专利名称：一种快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因农作物安全评价技术，尤其是一种快速评价转基因抗虫 棉抗蚜效果的方法。
背景技术：
目前关于转基因抗虫棉抗虫效果评价的技术主要有以下几种(1)笼罩接蚜试验法 把棉蚜接种在笼罩网内的棉花上，观察棉蚜为害棉花造成的蚜害指数和蚜害指数减退率；蚜重测定法将棉蚜接在棉花上，经过一段时间饲养后，称重棉蚜的体重，求得平均单蚜体重，以此为指标评价棉花对棉蚜生长发育的影响；(3)室内生命表法采用棉花或者棉叶饲喂棉蚜，按照生命表方法统计若蚜死亡率、若蚜历期、成蚜历期、繁殖力、世代净生殖率、 世代生长周期和种群内禀增长力；(4)蜜露法根据棉蚜在棉花上的取食量与其所排泄蜜露多少成正相关的特点及蜜露与溴甲酚绿呈色反应生成深蓝色斑点的原理，以量度色斑面积间接判断棉蚜拒食的程度。上述评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法主要存在以下缺点(1)需要大量的蚜虫来进行测定，一般需要上百头或者上千头蚜虫；(2)测定周期过长，一般需要数十天或者数月之久。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、无污染且方法简单的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案
该快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，包括以下步骤
(1)设备和待测材料的准备
检测仪器为昆虫直流刺吸电位仪(electrical penetration graph)。棉花生育期为苗期4-5片真叶期。用水溶性导电银胶将棉蚜的背板和金丝电极相连，放置棉蚜于待测棉苗叶背上适应1-3小时后，金丝电极的另外一端连接刺吸电位仪放大器；
(2)检测和记录
检测开始，棉蚜刺吸取食行为产生的电信号经昆虫刺吸电位仪放大处理后通过采集软件和模拟一数字转化卡记录在电脑硬盘上，记录一段时间后结束；
(3)信号分析和计算
利用分析软件分析每头棉蚜在测定时间内口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的次数和每次出现持续的时间，计算①棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值；②棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比；
(4)判断转基因棉花对棉蚜的抗虫效果
①抗蚜转基因棉判断标准棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值小于10分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比小于12%，则该品系转基因棉对棉蚜有较高的抗性，棉蚜不喜欢取食该棉花；
②非抗蚜转基因棉判断标准棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值大于14分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比大于27%，则该品系转基因棉对棉蚜没有抗性，棉蚜喜欢取食该品系棉花。与现有同类检 测方法或技术相比，本发明具有以下优点
(1)评价时间短，方法简单一台八通道刺吸电位系统2天的时间就可以测定20头棉蚜的刺吸行为，这些数据就可以用来评价一个转基因棉花品系对棉蚜的抗性效果。而生命表法和笼罩饲养等方法费时费力，需要每天花费大量精力观察昆虫的取食情况和测量昆虫的生长发育指标。本发明可以直接测定棉花植株，不用对植株进行其他处理；
(2)评价方法精确本方法可以从不同指标描述棉花对棉蚜的抗性，不但能够分析棉蚜是否喜好取食该棉花品系，而且能够分析棉蚜喜欢取食或者不喜欢取食的行为生理基�。� 这是其他评价方法所不能比拟的；
(3)评价不需要大量的昆虫，准确性高，重复性好检测了多个转基因抗虫棉，准确率达到 100%。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述并非是对本发明内容的限制。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应变化，仍属于本发明的保护范围。实施例1
(1)设备和待测材料的准备
检测仪器为4通道昆虫直流刺吸电位仪(electrical penetration graph)。待测2个棉花品系为Al和A2，生育期为苗期4片真叶期。用水溶性导电银胶将棉蚜的背板和金丝相连，放在棉苗叶片上适应1小时后，金丝电极另外一端连接刺吸电位仪放大器。每株待测棉苗上只能放置一头棉蚜无翅成蚜，吸电位仪放大器每个通道只能连接一头棉蚜，棉苗和棉蚜均使用一次；
(2)检测和记录
刺吸电位仪记录开始。输出信号使用WinDaq Lite采集软件(Dataq instruments, Inc.)，通过模拟一数字转化卡(DI-720，Dataq instruments, Inc.)记录在电脑硬盘上。 记录6小时后结束。Al和A2品系棉花分别获得20株棉苗上棉蚜有效的数据；
(3)信号分析和计算
利用分析软件WinDaq Lite采集软件(Dataq instruments, Inc.)分析在测定时间内棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的次数和每次出现持续的时间。计算①棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值；②棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比；上述①和②棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形分为唾液分泌对应的El波和被动吸食植物汁液对应的E2波； ⑷结果及评价棉花对棉蚜的抗性效果
对于棉花Al和A2品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值分别为5. 47分钟和19. 06分钟，而棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比平均值分别为9. 93%和30. 9% ；
按照评价标准，对于Al品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为5. 47分钟，小于10分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食产生波形出现的时间总和占总测定时间的百分比平均值为9. 93%，小于12%，则该转基因棉对棉蚜有较高的抗性， 棉蚜不喜欢取食该棉花汁液；
对于A2品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为 19. 06分钟，大于14分钟，且蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比平均值为30. 9%，大于27%，则该品系转基因棉对棉蚜没有抗性，棉蚜喜欢取食该棉花。测定品系Al是转基因抗蚜转基因棉花，A2为其亲本非抗蚜棉花，系非转基因常规棉。因此本发明的测定结果与实际相符。实施例2:
与实施例1的操作条件相同，所不同的是待测棉花品系分别为Bl和B2。检测结果表明对于Bl和B2棉花品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值分别为7. 99分钟和22. 99分钟，而棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比分别为9. 93%和40. 45% ；
按照评价标准，对于Bl品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为7. 99分钟，小于10分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比平均值为9. 93%，小于12%，则该转基因棉对棉蚜有较高的抗性， 棉蚜不喜欢取食该棉花汁液；
对于B2品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为 22. 99分钟，大于14分钟，且蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比平均值为40. 45%，大于27%，则该转基因棉品系对棉蚜没有抗性，棉蚜喜欢取食该棉花品系。测定品系Bl是转基因抗蚜转基因棉花，B2为其亲本常规棉花，系非转基因常规棉。因此本发明的实验结果与实际相符。实施例3:
与实施例1的操作条件相同，所不同的是待测棉花品系为抗虫转基因棉SGK321。检测结果表明棉蚜口针在SGK321棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为 31. 68分钟，棉蚜口针在SGK321棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比平均值为30. 16% ；
按照评价标准，对于SGK321棉花品系，棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为31. 68分钟，大于14分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比平均值为30. 16%，大于27%，则SGK321转基因棉对棉蚜没有抗性，棉蚜喜欢取食该棉花品系。测定棉花品系SGK321是转基因抗棉铃虫棉花，系非抗蚜转基因棉花品系。因此本发明的实验结果与实际相符。
权利要求
1.一种快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，包括以下步骤(1)设备和待测材料的准备检测仪器为昆虫直流刺吸电位仪(electrical penetration graph, EPG)，棉花生育期为苗期4-5片真叶期，用水溶性导电银胶将棉蚜的背板和金丝电极相连，放置棉蚜于待测棉苗叶背上适应1-3小时后，金丝电极的另外一端连接刺吸电位仪；(2)检测和记录检测开始，棉蚜在转基因棉花上的刺吸取食行为产生的一系列电信号经昆虫刺吸电位仪放大处理后，通过信号采集软件和模拟一数字转化卡记录在电脑硬盘上，记录一段时间后结束；(3)信号分析和计算利用分析软件分析每头棉蚜在测定时间内口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的次数和每次出现持续的时间，计算①棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值；②棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比；(4)判断转基因棉花对棉蚜的抗虫效果①抗蚜转基因棉判断标准棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值小于10分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比小于12%，则该品系转基因棉对棉蚜有较高的抗性，棉蚜不喜欢取食该棉花；②非抗蚜转基因棉判断标准棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值大于14分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比大于27%，则该品系转基因棉对棉蚜没有抗性，棉蚜喜欢取食该品系棉花。
2.根据权利要求1所述的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，其特征在于所述步骤⑴中的测定仪器昆虫直流刺吸电位仪(electrical penetration graph)系荷兰 Wageningen University生产，为4通道(Giga4型号)或者8通道(Giga8型号)。
3.根据权利要求1所述的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，其特征在于所述步骤⑴中每株待测棉苗上只能放置一头棉蚜无翅成蚜，刺吸电位仪放大器每个通道只能连接一头棉蚜，每株棉苗和每头棉蚜只能使用一次。
4.根据权利要求1所述的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，其特征在于每个品系的待测棉花至少成功测定20株棉苗。
5.根据权利要求1所述的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，其特征在于所述步骤⑵测定时间为4-6小时。
6.根据权利要求1所述的快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法，其特征在于所述步骤⑶棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形分为唾液分泌对应的El波和被动吸食植物汁液对应的E2波。
7.根据权利要求1所述的快速检测转基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步骤⑶中① 棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值为所有测定棉蚜吸食汁液对应波形持续时间的平均值，②棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比为所有测定棉蚜该值的平均值。
全文摘要
本发明公开了一种快速评价转基因抗虫棉抗蚜效果的方法。检测仪器为昆虫刺吸电位仪。步骤包括连接棉蚜和金丝电极；检测和记录棉蚜在待测棉花上刺吸取食时产生的电信号；记录一段时间后结束，分析棉蚜在测定棉花上刺吸取食产生的波形；评价转基因棉花对棉蚜的抗虫效果棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应的波形每次出现持续时间的平均值小于10分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占测定时间的百分比小于12%，则该品系转基因棉对棉蚜有较高的抗性；棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形每次出现持续时间的平均值大于14分钟，且棉蚜口针在棉叶韧皮部吸食对应波形出现的时间总和占总测定时间的百分比大于27%，该转基因棉品系对棉蚜没有抗性。与现有同类检测方法相比，本发明检测速度快，方法简单，成本低，重复性好，准确率高。
文档编号G01N27/00GK102331442SQ20101061100
公开日2012年1月25日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者周琳, 崔金杰, 汤清波, 蒋金炜, 贾述娟, 郭线茹, 闫凤鸣, 雒珺瑜, 马英, 高佳 申请人:河南农业大学
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