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专利名称：用于流体中微颗粒的多参数测量的装置和方法
用于流体中微颗粒的多参数测量的装置和方法
背景技术：
本发明涉及用于执行流量測量以表征尤其是在生物学细胞中的微颗粒的装置和方法的一般领域。本发明更具体地涉及测量生物学微颗粒的折射以及在生物医学应用中有用的其他參数。在当前语境中，大部分自动细胞学分析器，诸如血液病学分析器，被设计成测量细胞特性，使得化验室医生能够识别特定疾病的起因。例如，诊断特定的贫血、特定癌症或追踪特定的医学处置全都是通过观察每个细胞的物理特性来执行 的。本发明的目的是开发ー种装置和方法，从而更好地区分以及由此更好地统计生物试样，尤其是血液中包含的颗粒群体中的每个。本发明还能够非常精确地测量每个红细胞群体的细胞内血红蛋白含量。通过扩展，本发明的装置和方法能够更好地分析样本中的白细胞群体。至于红系细胞，最常见的分析器提供的常规參数如下每单位体积的红细胞数(#RBC)、平均细胞容积(MCV，常规上按照立方微米给出(iim3))、红细胞分布指数(或宽度)(以％表示的RDW)、血细胞压积水平(以％单位的HT)、基本样本中的平均血红蛋白浓度(HB)、平均红细胞血红蛋白浓度(以每分升克(g/dL)为单位的MCHC)和平均红细胞血红蛋白量(以皮克(Pg)为单位表示的MCH)。大部分血液病学分析器測量如下參数#RBC、HB和血细胞压积水平，通过计算获得所有其他參数。尽管如此，应当观察到，能够利用特定类型的分析器来測量大部分不成熟的红细胞，其包含核糖核酸(RNA)的残渣并且被称为“网织红细胞”。然后使用染料或荧光标记器作为着色剂来掲示细胞质内RNA的存在。表达对RNA标记特有的荧光或衍射信号的红细胞的分数比例用于确定每单位容积的网织红细胞数(#RET )。除了这些參数之外，诊断特定的贫血或跟踪对它们的处置情况需要知道每个红细胞和/或每个网织红细胞的红细胞血红蛋白浓度(CHC) (CHCr :网织红细胞的红细胞血红蛋白浓度)。与參数MCHC和MCH (它们是在红细胞的整个群体上计算的平均值)不同的是，CHC和CHCr是每个血细胞中红细胞血红蛋白浓度的值，并且它们被用于构造直方图，示出红细胞群体上的血红蛋白分布以及不成熟的条纹(网织红细胞)。例如，平均红细胞血红蛋白浓度相同的两个患者可能呈现出在红细胞和网织红细胞上非常悬殊的统计分布。这是细胞学中公知的。因此，在利用显微镜检查涂片时，红细胞的颜色与其血红蛋白含量強烈相关血红蛋白浓度越大，光衰减越大。该发现是Beer-Lambert定律的结果,该定律表明，光密度与溶质的浓度成正比。关于不同细胞之内血红蛋白统计分布的知识提供了关于患者健康状态的信息。偏离常态是要由化验室医生解释的症状。例如，将血红蛋白含量低的红细胞说成“低色素性的”，而将血红蛋白含量高的红细胞说成“高色素性的”。在红细胞之间的血红蛋白分布变化强烈时，这是多染色性症状。含量异常的细胞常常呈现出异常的流变性质，并且导致其他生理症状，尤其是对于地中海贫血或铼状细胞病。在Onofrio等人于 1995 年 Blood, Vol. 85,第 818-823 页中发表的题为 “Simultaneous measurement ofreticulocytes and red blood cell indices in healthy subjects and patients withmicrocytic and macrocytic anemia”的文章中阐述了这些參数对健康受治疗者和患者而
言的血液学解释。因此当前认为网织红细胞的血红蛋白含量是对于诊断中枢性贫血，或甚至追踪患者对治疗响应而言都非常有用的參数。此外，近年来已经在业内评论性刊物和众多专利申请中发表了很多公开，都是关于血红蛋白在所有红细胞内分布的临床解释以及关于为获得该信息要实施的方法的。例如，缺铁性贫血涉及到群体的各种外围 ，尤其是进行透析的人，他们定期进行铁负载平衡。出血或流血的人、接受血液透析治疗的人，甚至营养不良的人都易于患缺铁性贫血。此外，利用促红细胞生成因子(EPO)治疗的受治疗者即使在他们的组织铁储备充分或甚至过多时仍可能发展成缺铁性贫血综合症，因为合成血红蛋白的机制受到铁固定代谢的反常的限制。在诊断那些生物失调时常常使用铁蛋白和铁传递蛋白饱和系数的化验，但认为在炎症性综合症或传染的情况下，那些特殊蛋白质的血浆浓度受到其他因素影响。题为“Reticulocyte hemoglobin content (CHr) early indicator of irondeficiency and response to therapy，，的文章(Brugnara 等人，Blood 1994, Vol. 83,第3100-3101页)指出，可以通过測量网织红细胞的绝对计数和微粒子血红蛋白浓度来追踪对补充ロ服铁的响应。于是，对治疗做出正面响应的人从第一天开始就同时受益于网织红细胞数量増加和血红蛋白负载增加。然而，成熟红细胞指数不受影响，直到治疗之后很长时间，通常仅为几个星期。因此，測量#RET和CHCr直方图在事先确定治疗是否有效时非常重要。因此，知道了血红蛋白浓度在红系细胞内的统计分布，甚至在其部分上的分布，对于可从大部分血液病学分析器获得的其他更多常规參数而言是最为有利的。至于血小板，最有利的是医生能够统计和观察血小板活化，因为那可能表示形成血栓一开始的聚集现象。活化与非活化血小板之间的这种区别在血液病学分析器上较难观察到。还在大尺寸血小板(宏血小板)与小红细胞(尺寸非常小的红细胞)之间进行区分的能力对于避免造成特定诊断错误而言是重要的。令人遗憾的是，在除了基于激光的那些血液病学分析器中，当前没有避免宏血小板与小红细胞之间这种可能混淆的简单而有效的解决方案。至于白系血细胞，显然，在各种细胞之间进行精确区分对于化验医生能够做出高质量诊断是相当有利的。例如，文章“ The cytoplasmic refractive index of丄ymphocytes,its significance, and its changes during active immunization，，(K. ff. Keohane 和 ff. F. Metcalf, 1959 年 I 月 I 日，Experimental Physiology, 44,第 343-350页)指出，測量淋巴细胞的折射率能够确定它们在接种疫苗之后的活化水平。为了测量红系细胞的血红蛋白含量，已经基于光学測量，主要是细胞反射或衍射的測量，提出了基于流式细胞术的很多方法，任选地将这种测量与通过测量微孔以连续或脉冲方式工作的电测量组合。测量微粒血红蛋白的第一种方法归功于D. H. Tycko。在美国专利No. 4735504中，作者描述了ー种基于光衍射的光学方法，光衍射是在空间的两个区域中测量的，所述两个区域是由对应于通过计算获得的非常具体的角的两个參数标识的。应当发现，红细胞先前通过化学方式处理过，因此为其赋予了准球形形状。在该近似的极限之内，可以将红细胞视为半径为R且折射率为IDX的均匀球体。向该简化的红细胞模型应用米氏(Mie)理论能够确定在三维空间的每个区域中扩散的強度，井能够确定等浓度和等容积曲线不相交而是相反界定ー组明确曲线的最佳配置。该组曲线使得能够解决逆问题，包括基于检测系统两个子光圈中衍射的光的两次测量确定球的体积和折射指数。同一作者在美国专利No. 5194909第4栏第39到57行中描述了该光学方法的复杂性。除了对衍射光进行两次測量之外，D.H. Tycko提出通过常规Wallace Coulter技术测量细胞的体积，包括測量生物学细胞通过微孔导致的阻抗变化。该电测量与光学系统单个光瞳中衍射的光的测量结果相关。再一次，Tycko基于两个角度(Qlj; 0H)确定环形光瞳，所述两个角度用于界定一组曲线，唯一地基于光学系统光瞳中衍射的光的測量结果给出红细胞血红蛋白含量的单ー解。从如下发现开始校准由Tycko提出的方法非常难以实施，因为不可能利用常规 乳液珠进行校准，俄国的Novossibirsk团队发展出ー种原创构思，能够测量微颗粒弥散指标。该系统被称为“扫描流式细胞仪(SFC)”。光源、微颗�：吞綔y器之间的角度是液流中微颗粒运动的函数。因此，微颗粒的运动使得能够扫描一定角度的扇形，使得能够在较大角度范围上记录衍射光指标。俄国团队的各成员应用SFC測量红细胞的体积和血红蛋白含量。在题为 “Calibration-free method to determine the size and hemoglobinconcentration of individual red blood cells from light scattering，，的文早(Sem，yanov 等人,Applied Optics, Vol. 39,No. 31,2000 年 11 月)中，作者指出红细胞产生的衍射图案给出一系列极大值和极小值。组合那些极值的位置和幅度特性以便获得计算算法，从而能够推断出红细胞的体积和血红蛋白浓度而无需进行事先的校准操作。在美国专利No. 5817519和6025201中，必须要使用激光以测量小角度下的衍射。该测量基于米氏理论，于是所用的原理类似于Tycko描述的装置中使用的原理。于是，在那些文献中，组合衍射測量与采集另一信号，可以是光信号或单个电信号，仅能够计算血小板的折射。通过所述电光装置不能区分其他细胞。在BeckmanCoulter Inc.名下的US 2005/0134833 中，D. L. Kramer认为基于测量前向光衍射的方法容易出错，因为它们依赖于细胞折射，其自身取决于细胞质内的折射率。他指出，折射率可能作为除血红蛋白之外的溶质，尤其是盐的存在而显著改变。他推荐了ー种基于反射率测量的装置，以便避免其他系统的不精确。他的装置的操作被应用于测量红细胞血红蛋白。将反射率测量与细胞体积测量组合,细胞体积测量是基于Coulter原理通过基于测量微通道阻抗变化的技术获得的，所述微通道具有通过其的连续电流。尽管未证实该装置的有效性，但作者指出，反射率參数与血红蛋白含量相关。在同一公司提交的专利WO 97/26528中提出了ー种非光学方法。在该专利中，通过执行两次电測量来确定血细胞血红蛋白含量一次是连续測量，另一次在脉冲条件下。在连续条件下，測量细胞的外部体积，而在脉冲条件下，场与细胞质内提供导电性的含量相互作用，似乎受到血红蛋白浓度的控制。还应当观察到，上述发明或公开仅涉及到測量红细胞的血红蛋白含量，未提到任何网织红细胞。
在流式细胞术中，仅能够在特殊标记核糖核酸之后检测网织红细胞，例如，如在申请人提交的专利FR 2759166中所述。ー项比较检测网织红细胞的各种方法的研允(“Reticulocyte enumeration past present，，，Riley 等人，Laboratory Medicine,Vol. 32，No. 10,2001年10月)特别发现，荧光方法提供了最好的性能。更具体而言，发现噻唑橙化合物是核酸(DNA和RNA)的最佳标记之一。该分子有优势是因为它强烈吸收入射光并且在与核酸混合之后荧光产出非常高。在用于自动统计网织红细胞的所有Horiba医疗分析器中都提出了这种方法(“Automated reticulocyte counting and immaturereticulocyte fraction measurement，，，Lacombe 等人，American Journal of しlinicalPathology, Vol. 112，No. 5，1999 年 11 月)。例如，Miles Inc.名下的美国专利No. 5350695描述了ー种利用恶嗪750或新亚甲基蓝对核酸着色的方法。恶嗪750导致核酸沉淀，由此能够通过消光測量来检测它们。 作者发现，他们的发明依赖于针对常规上述Tycko装置调整消光測量。排他地使用吸收测量来区分未成熟细胞，尤其是网织红细胞，而使用衍射信号计算包括体积和血细胞血红蛋 白含量的球状指数。在该专利中，人们公认分辨未成熟细胞所需的吸收测量与衍射测量是相互依赖的。为了减少这样的干扰，如范例3第15和16栏中所述，作者提出细胞间校正方法。令人遗憾的是，那些计算是复杂的，并且可能不精确，因为它们需要对两种小幅度光学现象解耦合第一是折射效果，而第二是吸收效应，在信号測量光学消光中将那两种效果混合在一起。对那种校正方法的第一个限制是，假设血细胞是完美均匀的球体。使用米氏理论计算要从光学消光信号减去的信号比例。该计算给出新的吸收值，该吸收值可以唯一地归因于染料的贡献，并用于测量核酸的量，从而确定红细胞的成熟度。文献US 5350695的图18比较了所述方法和手工计数方法之间统计网织红细胞的結果。尽管未给出相关系数，但能够看出，测量是高度分散的，并且网织红细胞计数的不精确度低于2%。然而，已知红细胞的平均寿命为120天因此能够估计出红细胞的更新率平均等于每天0. 8%，从纯粹生物学的角度来讲这解释了需要有一种能够測量低于2%细胞的敏感方法。仍然在Miles Inc.名下的美国专利No. 5360739描述了ー种确定血细胞血红蛋白含量的方法，其基于Tycko的原理，即在分别称为“红散射低”和“红散射高”的两个衍射角下測量光衍射，而网织红细胞測量基于测量光学吸收，如在美国专利5350695中那样，但基于荧光作用的原理。作者考虑使用两种能光激励的化合物，一种为红色(恶嗪750)，另ー种为蓝色(吖啶橙及其衍生物)。在这种环境下，作者提出耦合血管上游的两束激光，使得光束在測量点处重合。所提出的光学装置使用重合的照明和检测轴，由此引入相当大程度的复杂性，因为在使用在蓝色中能光激励的化合物时，该装置需要使用四个测量通道。在该方法中，优选全光学方法，用于确定血样中包含的每个红细胞和每个网织红细胞的感兴趣參数(体积和红细胞血红蛋白浓度)。Abbott名下的美国专利No. 6630990以基本等效于上述方法的方式解决了测量红细胞血红蛋白浓度的问题。该专利提出了ー种光学装置，能够分辨多种细胞系，尤其是白系血细胞和红系血细胞。该系统具有单个光源和单个接收器，提供三个测量区域，定义独特的配置，以利用米氏理论计算血细胞血红蛋白和细胞体积。主要特性依赖于使用三个衍射角计算体积參数V和血细胞血红蛋白HC，由此从技术角度导致显著的复杂性，因为如果増加荧光作用作为测量红细胞成熟度的參数，必需有特定的探測器并且由工作于三维或四维空间中的方法处理数据。校准装置的方法复杂也是那篇文献中未解決的重要问题。Sysmex针对XE2100分析器提出了參数RET_y。几个团队已经进行了各种试验研究，以便评估这种RET-y參数的临床优点。例如，文章“New red cell parameters on theSysmex XE_2100as potential markers of functional iron deficiency^Briggs 等人，2001, Sysmex Journal International, Vol. 11,No. 2)指出，參数 RET-y 与网织红细胞的血红蛋白含量相关。该參数是仅限于网织红细胞群体的前向散射(FSC)的平均值，是从流式细胞术分析的细胞样本的两參数FSCXFLU0表达计算的，其中，常规上，參数FSC对应于小角度的衍射，參数FLUO对应于聚甲炔的荧光作用，其在红色中能光激励，并用于标记和量化核酸(DNA/RNA)。新近以来，在文章“Potential utility of Ret-Y in the diagnosis ofiron-restricted erythropoiesis，，(Franck 等人,Clinical Chemistry 50 :第 1240-1242页，2004)中，C. Briggs等人描述了类似結果。作者发现，參数MCH和CHr与參数RET-y相关。还提供了一种非线性回归方法，能够利用商标为Bayer的參考Advia 120分析器校准 Sysmex XE2100分析器。在Sysmex于2007年3月提交的专利EP 1967840A2中描述并阐明了那些結果。令人遗憾的是，FSC的响应非线性可能导致显著的不精确，尤其是对于參数CHr的大值。具体而言，对于接近40pg的值，可以看出该方法不灵敏，因为在该值附近RET-y几乎不变。此外，该专利仅參考了网织红细胞群体，未调整FSXXFLU0两參数表达以测量循环的血液中其他颗粒，尤其是白细胞。如现有技术专利中所述，例如Tycko装置和从其推导出的装置，通过视直径位于5°到15°范围中的环形光瞳来測量小角度的衍射。为了以良好的信噪比在小角度测量衍射，那些装置利用了激光。在这种工作条件下，照射光束的数值孔径基本为零。从实际的角度来讲，使用激光是在数值孔径基本为零的情况下能够在有效测量小角度衍射所需的高功率(几毫瓦)下产生辐射的唯一方案。因此基于现有技术中描述的测量原理的装置很昂贵，因为它们包括激光器。此外，它们需要使用停止器以有效地停止激光束。由于停止器需要以大精度对准，以避免使探测器饱和，所以特别难以制造和调节基于该原理工作的装置。此外，现有技术装置对试剂使血细胞成球形的质量非常敏感。在利用小角度衍射工作的装置中，衍射现象基本对应于平面波的衍射，根据定义，平面波呈现出零发散。与微颗粒的那种交互的性质对微颗粒性质的效应非常敏感。此外，在微颗粒不是理想球形吋，測量结果包括显著的误差。已经通过试验发现了这种情况，如图IA和IB所示。这些是在1°到30°范围中的角度上测量的关于红细胞体积(RES)和激光衍射(FSC)參数的两參数曲线。图IA是利用ABX供应商的稀释剂(专利FR 2759166- l-luorcd )获得的，其拥有弱球形化指数，而图IB是利用同一系统，但利用球形化指数高的试剂获得的(对Advia 2120使用的Bayer稀释剂)。可以看出，图IA包括显著的误差，因为该组群体是高度分散的。相反，在图IB中，颗粒群体位于平面中界定ー集合的区域中，该集合更加紧凑，具有高度的FSCXRES相关性，如该集合的椭圆形所示。因此，显然，与測量系统无关，试剂的性质对现有技术装置的结果有很大影响
发明内容
于是，本发明的主要目的是通过提出如下方法来减轻这样的缺点ー种利用光源对流体中存在的至少两个细胞颗粒群体进行分类和折射流量测量的方法，所述光源的相干时间短、相干长度Lc〈100微米(y m)，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围所选择的中心波长处并在消光条件下使用，所述方法包括如下步骤 使用所述光源形成会聚的照射光束，其孔径角处在1°到60°、优选为10°到60°范围中，根据在选定的中心波长处针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择，并且提供的光照均匀度在尺度为aXbXc的矩形体积中好于10%，其中，aXb是高宽比a/b小于4的光束的矩形截面，其中，￡是景深，被定义为功率改变不超过10%的相对于测量点的距离范围，其值位于大约500iim±250iim处； 令具有颗粒的流体流经测量孔ロ ； 在所述颗粒经过所述测量孔ロ时測量阻抗波动(RES)； 令具生物学溶液在测量窗中流动，所述测量窗被置于出口的光束从测量孔ロ照射； 在所述颗粒通过所述測量窗时，測量所述光束在所述轴上的消光(EXT)，利用具有会聚接收光束的装置或探測器进行测量，所述会聚接收光束的孔径角处于1°到60°范围中，根据针对所考虑颗粒群体预期的体积范围和折射率范围选择； 合并所述RES和EXT数据以从其形成事件； 针对每个事件利用如下类型的表达式评估相对折射率IDX
Im EXT — BMRES + T) — DAMRES+ !) + ('其中，A、B、C、D和T是取决于测量周期的系数；以及 使用从RES、EXT和IDX中选择的至少ー个參数对所有事件分类。可以通过增加荧光作用测量以便在细胞成熟各级间进行区分来扩展本发明。如图2所示，本发明这样提出了ー种使用电光手段的方法，该手段简单并且能够測量若干细胞系的折射率(或折射)。在制备要利用本发明的方法进行测量的样本时，选择适当的试剂。本发明的创意在于，同时利用通过电气方法执行的体积测量和光学消光測量，来获得颗粒折射信息。应当看出，颗粒折射是与颗粒浸于其中的液体介质折射相关的测量，最后，颗粒的折射測量取决于表征测量装置的參数。于是，可以由两个物理大小的比值表示颗粒的折射或其折射率，记为 m=Ne/NL,其中，在给定的试验条件下，Ne是颗粒的折射率，队是颗粒浸于其中的液体介质的折射率，本文也将这ー相对折射率记为IDX。在细胞学分析中，尤其是在血液病学领域中，这种折射信息使得能够例如获得所考虑细胞群体的改进分类，或者可以提供关于细胞代谢的信息，因为它提供了关于细胞含量或关于其膜性质的额外信息。在本发明的方法中，不执行这种衍射測量以评估折射。本发明基于使用光学消光的測量。于是，相对于光亮背景，而非如现有技术装置那样相对于黑暗背景，来測量光信号。ー个直接效果是，不必使用激光器，其中，激光器一直是较为昂贵的部件并且比非激光源使用起来更为复杂。本发明的方法于是利用了非激光源，例如可以是半导体灯，如发光二极管(LED)、超级发光LED，甚至白炽灯。在本发明中，光学装置比现有技术装置简单。此外，实施更加容易，尤其是因为相对于光亮背景进行测量，所以不必在光电检测步骤之前停止照射光束。在本发明中使用的照射光束以大于10度的较大孔径角会聚，用于使红细胞的形状具有更低灵敏度。已知可以将不相干会聚光束分解成相对于 红细胞具有各种入射角的平面波频谱。照射光束的孔径角由这两个值之间的差异界定。根据优选特性，这个孔径角处于10°到60°的范围中。于是，与现有技术装置不同的是，由连续谱(spectrum)的平面波照射颗粒。每个波然后产生衍射图案，使得实测信号是所有平面波与被分析颗粒的集成响应。由于平面波中的每个从不同的角度看到颗粒，所以形状各向异性通过平均而“消除”。这解释了在面对颗粒形状条件，尤其是颗粒球形化时，本发明方法优于现有技术装置的原因。尤其是红细胞，通过对微颗粒进行化学处理获得这ー在先步骤，例如，化学处理的种类如 Y. R. Kima 和 L. Ornstein 在文章“Isovolumetric sphering of erythrocytesIor more accurate and precise cell volume measurement Dy flow cytometry”(Cytometry, 1983, Vol. 3, Issue 6, pp. 419-427)中所述。对于生物颗粒，例如红细胞的球形质量，本发明的光学装置更能够容忍。于是，降低了在球形化能力方面对试剂的要求。由于颗粒的球形化不再对实施测量方法是总体决定性的因素，本发明能够增强或生成其他化学功能，例如使膜可滲透，这是对颗粒内部的特定结构着色或标记所需的。于是，本发明能够基于测量颗粒的实际折射和其体积，通过测量阻抗和消光对被分析的颗粒分类。这样不仅能够确定根据折射区分的若干类别，而且能够确定颗粒在每ー类中的百分比作为其比例，使得比例之和总计为100%。在本发明的具体实施方式
中，如图27中所示，仅仅通过在接收系统中增加ニ向色反射镜Fl连同与光源SI轴成90°的激光器，本发明的光学装置还能够测量荧光作用，从而在红细胞和网织红细胞之间进行区分。通过同样的方式，该装置能够测量白细胞的荧光作用，从而能够根据荧光作用响应分离它们。具体而言，本发明提供了比先前发表的方案性能更好并且更简单的方案。该方法的应用在于测量红细胞和血小板的折射。知道了红细胞的折射能力就能够确定其血红蛋白浓度。更一般地，本发明能够确定红细胞和网织红细胞的血红蛋白含量，与全血样本中包含的其他细胞或微颗粒(尤其是用于稀释初始样本的各种流体传输的红细胞和本底噪声)相比改进血小板的分类，并确定血小板的活化水平。然后可以将本发明的方法扩展到循环血液中的所有细胞，以便对白细胞(尤其是淋巴细胞、单核白细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性细胞和其他有核细胞)进行分类和/或量化。根据有利特性，利用如下类型的表达式计算相对折射率
Jm EXT - B,In(燃 + 7')-DA.ln(RES + T) + ('其中，A、B、C、D和T是取决于测量周期的系数。这ー特性使得能够快速简单地计算折射率，因为它是从两个变量和简单的对数函数对折射率建模的表达式。有利地，被分析的颗粒是生物学液体中的细胞。
而且，根据本发明的优选特性，用于测量颗粒折射的波长位于红色和超过0. 6 y m的近红外区中。測量微颗粒体积的范围主要从0到500飞升(fL)。这尤其适用于红细胞和白细胞，还适用于血小板。对于红细胞，选定的波长范围确保了解的唯一性，给出了与每个细胞折射成正比的血红蛋白浓度，其自身由光学消光和阻抗测量确定。根据本发明的有利特性，对事件分类的步骤利用处于600纳米(nm)到SOOnm并且数值孔径NA1=NA2处于0. 2到0. 6范围中的波长分开红细胞和血小板。根据界定血小板所属区域的阈值执行这一分离步骤，该阈值具有默认值并且能够自动加以调节。这ー特性使得能够具有适于被观测样本的分离阈值。在本发明中，測量光学消光信号并与电阻信号相关联，以便构成事件。当在消光中未看到特定颗粒时，本发明的方法将它们与零消光相关联。这个子步骤仅基于其阻抗值处理这些事件。有利地，对事件分类的步骤包括如下子步骤通过在从所有遇到的颗粒准备的直方图中确定谷，调节不能測量消光的颗粒之间的电阻分离阈值。根据本发明的特定特征，对事件分类的步骤包括如下子步骤调节根据分离阈值之下遇到的颗粒的统计參数，即均值和标准偏差，计算的电阻分离阈值，所述分离阈值是由作为体积和光学消光函数的仿射直线定义的。还是在这种情况下，根据样本确定分离阈值的位置。这构成了原创性方法，因为大部分对红细胞(RBC)和血小板(PLT)分类的当前设备仅基于其体积这样做。这ー阈值这样能够对小红细胞尺寸的血小板分类，在观测小红细胞干渉的其他设备中不能这样做。虽然如此，现存一些设备利用激光进行衍射测量，但实施的方法比本发明的方法更复杂。根据本发明的另ー特定特征，对事件分类的步骤包括如下子步骤在旋转整个阻抗(体积)/消光平面之后调节由仿射直线定义的阈值，所述仿射直线是体积和(光学)消光测量值的函数，从而通过在从位于分离线任ー侧的事件的横轴点形成的直方图中确定谷来垂直地放置所述分离线。再次，根据样本确定分离阈值的位置。于是，本发明能够在血小板以及小尺寸红细胞之间进行区分，因此对其进行分类。根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤借助于作为其折射率IDX的函数的仿射表达式，计算被分类为红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。于是，本发明使得容易利用血细胞血红蛋白和折射率IDX之间的已知联系计算血细胞血红蛋白。有利地，该方法包括如下子分类步骤对低色素性、高色素性和正常色素的红细胞群体以及小红细胞、大红细胞和正常色素的红细胞群体进行分类。在这些群体在体积和折射方面有差异的范围之内，利用本发明进行的測量用以根据体积和血红蛋白含量在分类之前定义和配置的小红细胞、大红细胞、低色素性或高色素性群体之间进行区分。定义这些群体之间差异的方式常常是对每个实验室特有的。虽然如此，可以提供默认设置。根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤利用作为其折射率的函数的仿射表达式，计算被分类为血小板群体中的颗粒的密度。本发明使得容易通过从别处获知的密度和折射率关系评估血小板的密度。有利地，该方法还包括如下步骤从通过阻抗测量获知的其密度和其体积计算血 小板的干重。这ー步骤使得能够使用从生物学角度而言有意义并且重要的量值血小板小粒的量。在血小板变得活化时，排除这些小粒。于是，血小板密度掲示了血小板活化情況。已经活化的ー组血小板几乎不包含或不包含小粒。于是，測量折射率间接地測量了其活化程度。这里强调的是，颗粒折射率的测量是相对于颗粒浸于其中的介质而言的，还相对于对颗粒而言特有的结构而言。于是，血小板折射测量的解释还涉及其内部复杂性包含高折射小粒的血小板将具有明显的折射率，大于在被活化时丢失其小粒的同样血小板。最后，计算的折射率是体积等于已经产生与被分析颗粒(血小板、粒性白细胞等)相同的光学消光的微颗粒体积的均匀球体的折射率。根据特定特征，本发明的方法包括如下子分类步骤对正常血小板、活化的血小板、小的血小板和大的血小板进行分类。由于“大的血小板”概念涉及到体积，所以子分类可以适于每个实验室，如同红细胞那样。根据有利特性，对事件分类的步骤将白细胞群体分离为尤其包括淋巴细胞、单核白细胞、粒性白细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞，并且包括如下步骤a)使用第一ニ维(2D)阈值化子步骤(REXXEXT或VOLX IDX)分离与碎片、血小板聚集、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及b)使用相继的2D阈值化子步骤分离各种群体和它们的非典型或不成熟子群体，并包括i)自动调节淋巴细胞和中性粒细胞之间的阈值的子步骤；ii)动调节嗜中性和嗜酸粒细胞之间的阈值的子步骤；以及iii)自动调节单核白细胞和中性粒细胞之间的阈值的子步骤。本发明实现的折射率(IDX)变换使得能够使用更精确并且更加互不相关的信息。这样能够消除在光学消光中与体积相关的分量。于是，对从体积(VOL)和从折射率(IDX)计算的量值，而非对阻抗參数(RES)和消光參数(EXT)有利地执行2D阈值化处理。如上所述，统计学折射性质提供了比光学消光更精确的信息。之后，针对每个群体以不同方式解释信息，因此需要对群体分类。例如，可以针对淋巴细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒性白细胞等评估活化情況。有利地，该方法包括如下步骤借助于作为所计算的相对折射率的函数的仿射表达式，计算被分类为淋巴细胞的颗粒的活化指数。例如，在题为 “The cytoplasmic refractive index of lymphocytes, itssignincance and its changes during active immunization，，(Metcalf 等人，Experimental Physiology,44, pp. 343-350,1959)的文献以及文献“Changes in bloodlymphocyte cytoplasmic refractive index lollowing skin grafting in raobits，，(Metcalf等人，Blood 1972-39 pp. 113-116)中描述了淋巴细胞的折射率变化。本发明使得能够利用从别处获知的所述活化与计算的相对折射率之间的关系来评估淋巴细胞活化。根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤通过分析所述体积和光学消光的2D分布，并通过确定围绕所述淋巴细胞群体的统计学椭圆，为分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。利用本发明类似地能够利用体积和折射率信息确定围绕淋巴细胞的椭圆。此外， 在VOLX IDX平面中，2D统计性质能够访问更精确的附加信息，因为它不与体积相关。根据特定特征，本发明的方法包括借助于作为所计算的相对折射率IDX的函数的仿射表达式为分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数。因为这种小叶/颗粒度和所计算相对折射之间的关系，本发明使得容易评估中性粒细胞的小叶/颗粒度。根据本发明的有利特性，该方法包括如下步骤通过分析2D分布(阻抗和消光)或(体积和折射率)測量，并通过确定围绕中性粒细胞群体的统计学椭圆，为分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。这ー步骤使得能够获得平均指数。根据特定特征，对事件分类的步骤将嗜碱性粒细胞与其他白细胞群体分开，并且包括如下步骤a)使用2D阈值化来分离与红细胞碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及b)通过2D阈值化将嗜碱性粒细胞与其他白细胞分开，包括自动调节所述嗜碱性粒细胞与其他白细胞之间的阈值。使用“2D阈值化” ー词表示在RESXEXT、VOLX IDX平面中或在可用量值的任何组合的平面中进行阈值化处理。在保持次序关系的任何变换之后可能进行分类。在继续测量和分类之前，利用特定的试剂(例如来自供应商HoribaMedical的ABXBasolyse试剂)处理相关样本，该试剂维持嗜碱性细胞的细胞核-细胞质比例。可以通过在RESXEXT平面中执行阈值化处理来执行自动定位方法，并且包括分析在其细胞核周围“收縮”的其他白细胞的分布。从中心和标准偏差开始，然后在“收缩”的白细胞上设置阈值。其他阈值是固定的。利用其他形式的开窗和其他调节方法，本发明的方法能够在VOLX IDX平面中做同样的事情。有利地，本发明的方法包括如下步骤检测呈现出异常相对折射率并实际上对应于由于存在脂血、晶体、气泡等而导致的干扰的事件。这样的步骤用于检测样本质量，并从而检测已经对其执行的測量。
根据有利特性，该方法包括检测具有异常相对折射率和典型为乳液的体积分布的事件的步骤。然后检测到的事件包括干渉。于是本发明能够检测它们。根据有利特性，所述方法包括利用所选波长用于生成荧光现象的光来照射測量体积的步骤、在測量体积中测量所生成的荧光的步骤，而对事件分类的步骤包括调节荧光分离阈值的子步骤，所述阈值是从所遇到的颗粒的统计參数，即极大值和标准偏差计算的。通过向RESXEXT或VOLX IDX测量增加荧光作用测量，能够基于三种测量进行分类，给出关于事件的清楚信息条目。根据特定特征，对识别为红细胞的事件分类的步骤根据基于测量荧光作用并对应于红细胞的成熟的极限的阈值将红细胞与网织红细胞分开，所述阈值具有适于以自动方式调节的默认值。有利地，该方法包括如下步骤利用作为其折射率IDX的函数的仿射表达式，计算 被分类为网织红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。本发明使得更容易利用血细胞血红蛋白和IDX之间的已知联系，计算血细胞血红蛋白，包括对于网织红细胞的群体。根据特定特征，对识别为淋巴细胞或单核白细胞的事件分类的步骤根据针对荧光测量的阈值与具有高含量核酸(尤其是RNA)的其他颗粒分开，所述阈值对应于单核白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。根据特定特征，对识别为嗜中性或嗜酸性白细胞的事件进行分类的步骤根据荧光测量阈值分开粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞，所述阈值对应于粒性成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。本发明由此提供了ー种对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射进行分类和流量测量的方法。该方法使用的光源相干时间短、相干长度LKlOOym，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选定的中心波长处并在消光条件下使用。该方法使用ー种装置，该装置与光源协作以形成会聚照射光束，其孔径角是根据在选定中心波长针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。然后让具有颗粒的流体流经测量孔ロ，以便在颗粒通过时测量阻抗变化(RES)。所述具有颗粒的流体流经光束照射的测量窗，并且在颗粒通过测量窗时在光束轴上测量消光EXT，利用具有会聚接收光束的装置或探測器这样做，所述会聚接收光束的孔径角是根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。该方法合并RES和EXT数据，以便从其提取事件，使得能够针对每个事件评估相对折射率并利用从RES、EXT和IDX中选择的至少ー个參数对所有事件分类。


从參考附图做出的以下描述将明了本发明的其他特性和优点，附图示出了没有任何限制特性的实施方式。在附图中图IA和IB示出了利用现有技术装置在阻杭/激光衍射平面中获得的结果，分别利用了球形化能力低的试剂和球形化能力强的试剂；图2是本发明的装置的图示；图3A和3B示出了利用本发明的装置在阻杭/消光平面中获得的结果，分别利用了球形化指数弱的试剂和球形化指数强的试剂；
图4示出了作为红细胞血红蛋白浓度函数的水溶液折射率；图5针对入=650nm和NA=O. 3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视消光值；图6针对入=405nm和NA=O. 3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视区分值；图7针对入=800nm和NA=O. 3示出了作为其体积和红细胞血红蛋白浓度(g/dL)函数的红细胞视区分值；图8比较了针对两个不同分析器覆盖本參数高值和低值的28份血样測量平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的结果；图9A到9F示出了分别利用己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷和十二烷，利用本发明的装置进行的乳剂测量； 图10示出了作为折射率的函数的參数k和2的建模；图11示出了以RES作为其横轴，以计算的折射率作为其纵轴的平面中各种乳剂的图示；图12示出了 V0LXEXT平面中的RBC/PLT矩阵；图13是针对RBC和PLT分类的流程图；图14示出了利用RESXEXT矩阵的RBC/PLT分类；图15示出了图14的第一种选通期间使用的RBC/PLT矩阵的阈值；图16A和16B示出了调节电阻分离的子步骤实施；图17A到17C示出了调节消光分离的子步骤实施；图18示出了如何从折射率计算血红蛋白浓度；图19示出了按照体积和血红蛋白浓度进行的红细胞子分类；图20示出了按照体积和密度进行的血小板子分类；图21A和21B示出了微细胞摄入情况下的分类比较；图22A和22B示出了针对大血小板的分类比较；图23示出了 RESXEXT矩阵上的白细胞分类；图24示出了分析颗粒的2D椭圆分布针对白细胞群体的RESXEXT矩阵；图25A、25B和25C示出了分别用于正常血液和两种病理血液的VOLX IDX矩阵；图26A示出了用于鉴别嗜碱性细胞的通道上的RESXEXT分类，图26B和26C分别示出了利用VOLX IDX平面中的同样通道的正常血液和脂类干涉；图27示出了测量颗粒折射与测量荧光作用耦合；图28示出了 RESXFLU0矩阵，用淡灰色示出了红细胞，用黑色示出了网织红细胞；图29A和29B用淡灰色示出了红细胞的V0LXCHC矩阵，用黑色示出了网织红细胞，单独示出了网织红细胞的V0LXCHC矩阵；以及图30示出了针对白细胞如何在EXT X FLUO矩阵上在荧光作用中区分未成熟细胞。
具体实施例方式在其最简单的版本中，该方法依赖于测量细胞悬浮液的两个參数，悬浮液取自在特定试剂中稀释的总血样。试剂可以是与血液同浓度的稀释剂，例如由供应商HoribaMedical销售的“ ABX稀释剂”，或者可以是微分溶胞试剂，例如使用也是由供应商HoribaMedical销售的“ Leukodiff ”试剂进行红细胞的总体溶胞，同时保留来自循环血液的所有有核细胞。细胞悬浮液的特征在于每微升的细胞数，其自身取决于分析系统。例如，在借助于通量细胞计数装置，利用水聚焦原理，分析细胞悬浮液时，由血液同浓度稀释剂对总体血液的稀释约为I :1000。在试剂是用于差分溶胞时，稀释约为I :100。于是，对于可能正常或患病的血液，针对总血样的这些稀释水平能够制备每微升10到10000个细胞的细胞悬浮液。然后利用图2中示意性示出的装置获得测量的两个细胞特性，即I)通过电气方法測量的细胞体积V，以及2)光学消光信号。
图2中所示的装置包括光源S、聚光透镜LI、光阑D1、投影透镜L2、用于收集十字线D’ I的图像的收集透镜L3、光电探测器D2和聚焦喷嘴BFC。从图2中所示的工作于光学消光条件而非现有技术装置的激光衍射条件下的装置，获得图3A和3B。图3A是利用本发明的装置，使用供应商Horiba ABX销售的“Fluored”试剂(专利FR2759166)获得的。图3B是利用本发明的装置，使用供应商Bayer销售的具有强球形化能力的试剂获得的。在此应当观察出，在事件组的位置和组的形状两个方面，这些图都是可比拟的。将这些图与图IA和IB比较，可以看出，本发明的装置在实测颗粒的形状方面提供了更好的容限。在图2中所示的实施例中，直径为125 iim的毛细管将细胞悬浮液引导到聚焦喷嘴BFC，聚焦喷嘴由直径为50 y m的小孔构成。箭头表示的辅助流体用于使细胞悬浮液处于中心，直到其通过测量孔ロ。这一孔ロ用于由电方法进行体积测量。恒定的电流通过孔ロ。在颗粒通过孔ロ时，通道的阻抗被修改，并产生计数孔末端间电压的变化。这ー电压与颗粒体积成正比。这种测量方法是已知的，在本说明书中未描述用于实施该方法所需的任何电子装置。之后，将颗粒传输到光学分析窗ロ，通过投射强度尽可能均匀的光的十字线获得光学分析窗ロ。在每个颗粒上測量光学消光。应当观察到，根据本发明，照射光束为汇聚光束，其特征在于其数值孔径NA=Sin U，其中，u是光阑Dl处的半孔径角。在测量血管中，照射光束的数值孔径为NAl=n*sin U。常规上通过KOhiei 型装置获得均匀照明。KOhler照明的原理包括在透镜L2的光瞳中对光源s成像。这样能够，第一，具有位于透镜L2光瞳中的源s的单个图像，第二，使得光在十字线D’ I的图像中分布均匀。照明系统还可以基于使用成形的光学纤维，如申请人名下的专利W02006/053960中所述。光工作台的尺寸取决于光学窗ロ的尺寸，并且还取决于计数単元中射束的孔径。可以在平面Pi中定义拉格朝日不变量i=ku，其中，k是测量窗的半高，ii是光束的半孔径角。在光学系统中的所有点保持这ー不变量的值。为光阑Dl的特征尺寸使用符号d，为光阑Dl处的半孔径角使用符号e，以下关系成立I=hu=d 9 o
之后，光通量，写为�。�由光阑截取并由透镜L2收集，等于光束的几何范围，写为G，乘以源S的亮度L之积，即小=LG。由于在无损耗光学系统亮度L是守恒的，这一通量由几何范围G= Ssin2 0固定，其中，S是光阑的面积，0是半孔径角。不失一般性地，假设光阑是方形的并且边长为i。然后由以下表达式给出通量(J)=LG=Lnd2 sin2 0 ^ L n d2 0 2, BP ^ n L I2。这就表明，通量与如下量成比例 源的亮度L，这ー參数是源的特性，被定义为每单位面积单位立体角发射的通量(瓦每平方米每球面度(w/m2/sr));以及 拉格朗日不变量I的平方，这ー參数由计数单元内部光束的几何数据完全決定。重要的是观察到，一旦将I设置在測量室旁边，就能够仅改变源的亮度来増大光 学系统的功率。在实践中，光阑为矩形形状，并且其尺度由两个考虑因素決定。更大的尺度由外壳流体的尺寸决定，这ー直径基本是用于体积测量的孔ロ直径，直径大约为eoym。于是将这一尺度设置在100 U m左右。较小的尺度确定了测量的空间分辨率，即在彼此非常接近的两个细胞之间进行区分的能力。理想地，这ー尺度应当尽可能地小。对于以速度V通过光窗ロ的生物颗粒，窗ロ的最小尺度界定了细胞暴露于光通量的持续时间，以及由此界定了对应于吸收和衍射物理现象的电脉冲持续时间。在实践中，这ー尺度大约为30 iim。应当发现，在通过时，分析窗ロ的这一高宽比大约为3。理想地，应当从聚焦喷嘴距出ロ尽可能近地进行光学測量。在这一位置，因为液流的相干性，颗粒处于明确的位置。于是，从聚焦喷嘴BFC将光聚焦到出口紧后方相当自然。如果将从焦点到喷嘴出ロ的距离写为1，如果将喷嘴的半径写为X，那么umax=x/y。于是，喷嘴的尺寸越�。�形成光束孔径的可能性越大，并使得测光平衡越好。为了结束对本发明的装置的光学特性的这种描述，应当观察到，设置參数G，即成像光学系统的放大率，使得系统被完全定义。这ー參数是由空间考虑決定的。需要距透镜L2非常远地放置大尺寸的光阑，而小尺寸光阑能够使用更为紧凑的设置，因为它距透镜L2更近。从拉格朝日不变量，能够以任意方式设置參数9。于是，由关系d=I/0给出光阑Dl的尺寸。一旦已经设置了这ー參数，就充分确定了放大率G=h/d。如果设置了工作距离，如图2的装置上标记的0，那么对应值a =P/G是所确定的值。应当观察到，參数P自身是由通常由玻璃或石英制成的測量室的壁厚以及需要通过的流体厚度设置的，流体通过以便到达沿聚焦喷嘴BFC对称轴的点表示的颗粒上游。在设置工作距离P时，出于可用空间的原因，应当考虑到ー个光学厚度。最后，还确定了透镜的焦距，因为f= a ^/(a+^)D这样在第一级设置了图2装置的光学和几何数据。被颗粒衍射、反射或吸收的光在光的传播中造成扰动，由包括透镜L3和探测器D2的接收器探测该扰动。所有信号都对测量光学消光有贡献，下文称为消光并写作EXT。透镜L3与探测器D2相关联构成装置的接收器部分。在装置的最简单版本中，接收光束的数值孔径等于照射光束的数值孔径。数值孔径NA2=n*sin (v)是接收器光学系统的数值孔径。在装置的最简单版本中，接收光束的数值孔径等于照射光束的数值孔径。于是NA2=NA1。由于微颗粒是在折射率为n的同一流体中被照明和测量的，因此能够推论，角度M和I是相等的。更一般地，照射光束不必与用于观察微颗粒的光束具有相同数值孔径。这是光学显微术中公知的，其中，数值孔径定义照射光束的相干水平。此外，由于衍射现象一般是被照明对象处的场相干性的函数，所以预期光学系统的响应取决于照明系统的数值孔径NA1。已知微颗粒通过的平面中光场的相干半径大约为rc=入/W，其中，入是中心波长，!是照明光瞳的视直径。这是VanCittert-Zernike定理的结果。例如,在这ー专题上可以參考 L. Mandel 和 E. Wolf 的著作，“Optical coherence and quantum optics”, CambridgeUniversity Press, 1995,第 188 页。于是，在本发明中，可能需要根据光学消光需要在更多或更少敏感程度上结合形态信息来改变测量点处照明的空间相干性，对于更多或更少的敏感程度，空间频率的范围 可以更大或更小。例如，如果颗粒的空间频率高，由于表面颗粒度甚至颗粒内部的小粒(特定白细胞或血小板可能发生这种情况)，可以通过减小聚光透镜的数值孔径来降低照明的相干性。在这样的环境中，照射光束没有充分高的空间分辨率来掲示这些高空间频率的存在，測量光学消光对这种颗粒度将是敏感的。否则，与小粒的交互作用会得到增强，并且光学消光测量将相应地更多被标记。換言之，在对成像应用Abbe理论时，被分析颗粒的空间频率使入射光衍射。这种交互作用产生ー种谱，其特征在于在光与被分析对象交互作用之后具有角色散。用于观测的物镜由空间滤波器构成，其仅通过ー些空间频率。滤波器的通带由数值孔径NA2界定。要获得角频谱和相干效应的更详细描述,可以參考Joseph W. Goodman题为 “ Introduction to Fourier optics” 的著作(第 3 版，Roberts Company, Anglewood,Colorado, 2005,第 127 页，第 6 章)。巴黎 “ Institut d’ Optique，，的 S. Slansky 的工作提供了关于NAl和NA2对于非常简单的对象，例如白色背景上的黒点的同时作用的信息，并表明通过适当选择比值NA1/NA2来优选对比度。还可以參考例如S. Slansky 的文章“Influence de la coherence de丄，eclairage sur Ie contraste de I image d un point noir en presence cT un petitdefaut de mise au point，，[the Influence of the coherence of illumination on thecontrast in the image of a black dot in the presence of a small focusing error](Journal of Modern Optics, Vol. 2, No. 3,1955 年 10 月)。尽管本发明未使用对比度的概念，但可以将这样的概念类比为本发明的有效折射測量，其包括可能更大或更小空间频率下的结构信息。最后，被分析颗粒的有效折射对应于体积V与被分析颗粒体积相同的均匀球体的折射，该球体在特征为(NA1、NA2、Lc、A、互、
b)的同一装置上产生与颗粒自身相同的光学消光现象，其中，NAl是照明的数值孔径，NA2是接收的数值孔径，Lc是源的相干长度，\是中心波长，&是分析光学窗ロ的短尺度，处在颗粒的行进方向上，h是分析光学窗ロ的长尺度，垂直于颗粒的行进方向。例如，A. Doicu和 T. Wriedt 在其题为 “Equivalent refractive index of A sphere with multiplespherical inclusions”的文章中阐述了有效折射率概念的数值分析(J. Opt. A PureAppl.Opt. 3 (2001)，第 204-209 页)。最后，应当观察到，可以使用其他类型的光瞳，例如环形光瞳。这样的方案对应于未详细描述的本发明的特例。最后，应当发现，系统參数NAl、NA2、Lc、入、2和と的选择在很大程度上取决于待分析颗粒的特性。下文例示了为这些參数选择的值，用于测量循环血细胞的折射率。使用以下特性NA1=NA2=0. 3, Lc=15 u m, A =0. 650 u m,a=30 u m, b=90 U m。通过光窗ロ的颗粒吸收并散射照射光束的光。这两个现象有助于减小光电信号的直流分量，这里称为“消光”。 本发明与解释波/颗粒交互作用的机制相关。如下所述，这种交互作用是入射波干扰和被分析颗粒散射的波的微妙结果。使用了 Van de Hulst的理论方法，这是ー种衍射现象的近似理论，并且还称为异常衍射理论。根据本发明，研究平面波与均匀球体的交互作用在生物颗粒与焦平面附近的光束交互作用的领域内是有用的。在这一平面中，波结构基本是平面。如复电场表达的那样，可以将这一波如下书写E0 = e_ikz+uto假设这个波的幅度是一，然后由如下形式的球面波对扩散波建模Esca = S(0)---这ー表达式涉及到函数S( 0 )，其表示生物颗粒扩散的波幅度。具体而言，该函数掲示了扩散波作为參数0的函数的空间分布的信息。根据定义，针对0 =0定义消光參数，将其写为Cext。下文表明，可以将这一消光參数Cext表达为函数S(0)的函数。接近装置的光轴，可以观察到以下近似r = (x2+ v2 + z2f'~ =zfl+-—)1, ~ zfl +-—)
突 Ar假设x，y〈〈z，可以将轴る附近的波写为
,,x2+f2.
--)+(tM Hsac + H0 = S(0 = 0)----+ /
ikz
一/んノme^ik=+cote “ 2-2
== U).............................................................................................................................+ h o
ikz
^fc(￡!±Zl)=S{0 = 0) h^e....................................:— + Eq
ikz
权利要求
1.ー种利用光源对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射进行分类和流量测量的方法，所述光源的相干时间短、相干长度LKlOOym，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的中心波长处并在消光条件下使用，所述方法包括如下步骤 使用所述光源形成会聚的照射光束，其孔径角处于1°到60°范围中，根据在选定的中心波长处针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择，并且提供的光照均匀度在尺度为aXbXc的矩形体积中好于10%，其中，aXb是高宽比a/b小于4的光束的矩形截面，并且其中，￡是景深，被定义为功率改变不超过10%的相对于测量点的距离范围，其值位于大约500 ii m±250 ii m处； 令具有颗粒的所述流体流经测量孔ロ ； 在所述颗粒经过所述测量孔ロ时測量阻抗波动(RES)； 令具有颗粒的所述流体在测量窗中流动，所述测量窗被置于出ロ处的光束从所述测量孔ロ照射； 在所述颗粒通过所述測量窗时，測量所述光束的轴上的消光(EXT)，利用具有会聚接收光束的装置或探测器进行所述测量，所述会聚接收光束的孔径角处于1°到60°范围中，根据针对所考虑颗粒预期的所述体积范围和所述折射率范围选择； 合并RES和EXT数据以从其形成事件； 针对每个事件评估相对折射率IDX ；以及 使用从RES、EXT和IDX中选择的至少ー个參数对所有事件分类。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述会聚照射光束的孔径角处于10°到60°范围中。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其特征在于利用如下类型的表达式计算所述相对折射率 mx . EXT — B. MRES + Tト D — A.ln(RES + T) + C 其中，A、B、C、D和T是取决于测量周期的系数。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于被分析的颗粒是生物学液体中的细胞。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于用于测量颗粒折射的所述波长位于红色和超过0. 6 ii m的近红外区中。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤利用处于600nm到800nm并且数值孔径NA1=NA2处于0. 2到0. 6范围中的波长来分开红细胞和血小板，包括如下步骤根据界定血小板所属区的默认阈值来分开红细胞和血小板，所属阈值具有默认值并且能够被自动调节。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤通过在从遇到的所有颗粒准备的直方图中确定谷，来调节不能測量消光的颗粒之间的电阻分离阈值。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤调节根据分离阈值之下遇到的颗粒的统计參数，即均值和标准偏差，计算的电阻分离阈值，所述分离阈值是由作为阻抗和消光测量值的函数的仿射直线定义的。
9.根据权利要求6到8中的任一项所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤包括如下子步骤在旋转整个阻抗/消光平面之后调节由仿射直线定义的阈值，所述仿射直线是阻抗和消光测量值(RES，EXT)的函数，从而通过在从位于分离线的任ー侧的事件的横轴点形成的直方图中确定谷来垂直地放置所述分离线。
10.根据权利要求6到9所述的方法，其特征在于包括如下步骤借助于作为其折射率IDX的函数的仿射表达式，来计算被分类为红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于包括如下子分类步骤对低色素性、高色素性和正常色素的红细胞群体以及小红细胞、大红细胞和正�：煜赴�的红细胞群体进行分类。
12.根据权利要求6到9所述的方法，其特征在于包括如下步骤利用作为其折射率的函数的仿射表达式，来计算分类在血小板群体中的颗粒密度。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于包括如下步骤从通过阻抗测量获知的血小板密度和血小板体积来计算血小板的干重。
14.根据权利要求6到9和12到13中的一项或多项所述的方法，其特征在于包括如下子分类步骤对正常血小板、活化的血小板、小的血小板和大的血小板进行分类。
15.根据权利要求I到5中的任一项所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤将白细胞群体分离为包括淋巴细胞、单核白细胞、粒性白细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞，并且包括如下步骤 a)使用第一2D阈值化子步骤来分离与碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及 b)使用相继的2D阈值化子步骤来分离各种群体和它们的非典型或不成熟子群体，并包括 i)自动调节淋巴细胞与中性粒细胞之间的阈值的子步骤； ii)自动调节嗜中性与嗜酸粒细胞之间的阈值的子步骤；以及 iii )自动调节单核白细胞与中性粒细胞之间的阈值的子步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤借助于作为所计算的相对折射率的函数的仿射表达式为被分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤通过分析体积和光学消光的2D分布，并通过确定围绕淋巴细胞群体的统计学椭圆，为被分类为淋巴细胞的颗粒计算活化指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤借助于作为所计算的相对折射率IDX的函数的仿射表达式为被分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于包括如下步骤通过分析在阻抗和消光测量中或者在体积和折射率测量中的2D分布(REXXEXT或VOLX IDX)，并通过确定围绕中性粒细胞群体的统计学椭圆，为被分类为中性粒细胞的颗粒计算小叶度/颗粒度指数，所述椭圆由其中心的位置、其长轴、其短轴和其角度定义。
20.根据权利要求I到5中的任一项所述的方法，其特征在于对事件分类的步骤将嗜碱性粒细胞与其他白细胞群体分开，并且包括如下步骤a)使用2D阈值化分离与红细胞碎片、血小板聚集体、成红细胞、人为噪声等对应的本底噪声；以及 b)通过2D阈值化将嗜碱性粒细胞与其他白细胞分开,包括自动调节所述嗜碱性粒细胞与其他白细胞之间的阈值。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于包括检测呈现出异常相对折射率并实际上对应于由于存在脂质、晶体、气泡等而导致的干扰的事件的步骤。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于包括检测具有异常相对折射率和典型为乳液的体积分布的事件的步骤。
23.根据任一前述权利要求所述的方法，其特征在于所述方法包括利用所选波长用于产生荧光现象的光来照射測量体积的步骤、測量所产生的荧光的步骤以及在调节荧光作用分离阈值之后对事件分类的步骤。
24.根据权利要求6和23所述的方法，其特征在于对识别为红细胞的事件分类的步骤根据基于测量荧光作用并对应于红细胞的成熟的极限的阈值将红细胞与网织红细胞分开，所述阈值具有适于以自动方式调节的默认值。
25.根据权利要求6到9和24所述的方法，其特征在于包括如下步骤利用作为折射率的函数的仿射表达式，来计算被分类在网织红细胞群体中的颗粒的红细胞血红蛋白浓度。
26.根据权利要求15和23所述的方法，其特征在于对识别为淋巴细胞或单核白细胞的事件分类的步骤根据针对荧光测量的阈值将淋巴细胞或单核白细胞与具有高含量核酸HRC的其他颗粒分开，所述阈值对应于单核白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。
27.根据权利要求18和23所述的方法，其特征在于对识别为嗜中性或嗜酸性白细胞的事件分类的步骤根据荧光测量阈值分开粒性白细胞和不成熟的粒性白细胞，所述阈值对应于粒性白细胞的成熟极限，所述阈值具有默认值并适于以自动方式调节。
全文摘要
本发明涉及一种对流体中存在的至少两个颗粒群体的折射进行分类和流量测量的方法。该方法使用的光源相干时间短、相干长度Lc<100μm，在根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的中心波长处并在消光条件下使用。该方法使用一种装置，该装置与光源一起形成会聚照射光束，其孔径角是根据在选定中心波长针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。之后，让具有颗粒的流体流经测量孔口，以便在颗粒通过时测量阻抗变化(RES)。在所述颗粒通过所述测量窗时，由光束照明流经测量窗的具有颗粒的流体并在光束轴上测量所述光束的消光(EXT)，利用具有会聚接收光束的装置或探测器进行测量，所述会聚接收光束的孔径角是根据针对所考虑颗粒预期的体积范围和折射率范围选择的。该方法合并RES和EXT数据，以便形成事件，使得能够针对每个事件评估相对折射率并利用从RES、EXT和IDX中选择的至少一个参数对所有事件分类。
文档编号G01N15/14GK102792146SQ201180012834
公开日2012年11月21日 申请日期2011年2月2日 优先权日2010年2月10日
发明者A·乌兰卡, B·梅谢, P·尼林, S·兰博 申请人:赫拉巴Abx公司