专利名称：一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法
技术领域：
本发明属于潜在指纹显现技术领域，特别涉及一种基于电化学发光标记物的潜在指纹显现方法。
背景技术：
指纹由一种叫做摩擦嵴的脊状突起系列组成，具有非常特殊的生理结构和特征体系。指纹在法医鉴定及人身识别方面担任着重要作用，同时广泛应用于日常生活中的安全检验、访问控制、个人认证等领域。所谓潜在指纹，是指人的手指、手掌触摸物体时，由于分泌的汗垢和油脂与物面的相互作用，在物面上留下反映指掌面皮肤乳突线花纹的印痕(分为汗垢和油脂组成的嵴线区域以及凹陷的峪线区域)。这种印痕，在多数情况下不能被目力或仪器直接察见，如同照相感光胶片经过曝光形成潜影一样，需通过显影处理才能显示原·有的图像，所以称为潜在指纹。根据显现原理的不同，潜在指纹显现方法主要有三类光学显现法、化学显现法以及物理吸附法，其基本原理就是使用一种光线或物质作用于指纹印痕的汗液物质，使不能看见的汗液指纹变为可见的。近年来不断有研究者利用各种新技术进行指纹显现及指纹成分的检测，如质谱成像、红外/拉曼成像、免疫标记成像、扫描电化学显微成像及局部电流成像等。其中基于电化学原理显现潜在指纹的技术受到人们越来越多的关注。Shan等利用表面等离子共振光信号引起的局部电流变化来对指纹进行显现，并用于TNT检测，成果发表在Sicence上(Science, 2010, 327)。Qin等将扫描电化学显微镜(SECM)技术用于多种客体上的指纹显现，根据法拉第电流的变化来反应指纹的拓扑结构(Electroanalysis, 2012, 24，1_6)。尽管指纹显现方法繁多，但目前指纹显现技术中仍然存在诸多困难。例如，成功的潜在指纹显现非常依赖于指纹残留物的化学组成，实践中由于选用了不恰当的显现技术而破坏指纹物证的现象时有发生。再如，尽管扫描电化学显微镜技术是一种非常灵敏的非创检测技术，但是其检测过程费时，若得到厘米级图像需要耗费十几到几十小时。因此目前仍然需要一种技术简单、快速、适用范围广的方法对潜在指纹进行显现。电化学发光是电化学反应和化学发光相结合的产物，是通过将电能转换成辐射能实现的。由于电化学发光是在电极表面产生的，因此可以反应出电极反应活性，并且具有背景低、时空可控等优点。因此，电化学发光被广泛应用于成像研究，例如观察电极的功能区域、检查电化学活性位点等。同时电化学发光成像也已成功用于制备各种微电化学和微流体系统、筛选代谢物毒性以及检测肿瘤标志物蛋白等。电化学发光检测中最广泛使用的发光标记物为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的三联吡啶钌。当它标记蛋白、抗体或核酸时，酯链断裂，与生物分子上的氨基结合。目前，将活化的三联吡啶钌复合物用于指纹标记并进行电化学发光成像未有报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法；该方法简单、快速、发光强度高。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法，该方法在电化学发光成像系统上实现；电化学发光成像系统包括电化学反应池、恒电位控制仪和CCD照相机，电化学反应池包括底座和池体，底座上具有凹槽，池体中空，通过0型密封 圈和螺丝固定在凹槽上，池体一侧有一小孔；恒电位控制仪包括工作电极、对电极和参比电极，参比电极安放在小孔内，其中，工作电极为ITO (铟锡氧化物导电玻璃),对电极为钼环,参比电极为Ag/AgCl电极或Ag电极；该方法包括以下步骤
(I)电极预处理将工作电极依次在丙酮、乙醇和去离子水中各超声清洗10-20min，再用去尚子水彻底冲洗干净，用IS气吹干。(2)指印样本制备用胶带将不同客体上的指印提取下来，然后转移到工作电极上，形成指印样本；
(3)用活化的三联吡啶钌复合物标记指印将50 活化的三联吡啶钌复合物涂覆在指印样本上，盖上表面皿防止溶液挥发，在室温下反应
30min以上，用去离子水冲洗样本以除去未反应的复合物，用氩气吹干；
(4)电化学发光成像将上述处理的工作电极、对电极和参比电极置于电化学反应池中，然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池中，恒电位控制仪通电，CCD照相机采集指纹图像；所述反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入50mmol 二正丁基乙醇胺和
0.15mol氯化钠组成，磷酸盐缓冲溶液的pH为7. 4，恒电位控制仪的电位为I. 3V。进一步地，所述步骤(2)中，所述客体包括但不限于电脑屏、光盘、硬币、桌面和不锈钢器具。进一步地，所述步骤(3)中，所述活化的三联吡啶钌复合物为N-羟基琥珀酰亚胺活化的三联吡啶钌。本发明的有益效果是，
I、该方法检测迅速，只需数秒钟即可得到厘米级图像，远远快于扫描电化学显微镜技术(十几至几十小时)。2、不需要昂贵仪器；不需要外加激发光源，因此不存在背景光干扰，优于荧光法。3、由于电化学发光反应是由固定在指印上的发光体与溶解在反应溶液中的共反应剂产生的，因此发光体的自猝灭效应低，显现效果明显优于荧光法。4、该方法灵敏度高，既可以用于显现油潜指印，也可用于显现活性物质较少的汗潜指印。5、与传统共反应剂三正丙胺相比，该方法使用的共反应剂二正丁基乙醇胺具有发光强度高、环境友好的优点。
图I是电化学发光成像系统示意 图2是电化学反应池的结构示意 图3是用活化的三联吡啶钌复合物处理3. 5h的油潜指印的电化学发光 图4是用活化的三联吡啶钌复合物处理6 h的油潜指印的电化学发光 图5是用稀释两倍的活化的三联吡啶钌复合物处理3. 5h的油潜指印的电化学发光 图6是用活化的三联吡啶钌复合物处理3. 5h的汗潜指印的电化学发光 图中，电化学反应池I、恒电位控制仪2、CXD照相机3、底座4、池体5、凹槽6、O型密封圈7、螺丝8、小孔9、工作电极10、对电极11、参比电极12。
具体实施例方式本发明的原理是人类手指表面皮肤布满汗腺，触物留痕。一般来说留在客体表面的指纹物质较少，一般为0. Ilmg,其中99%为水分,会迅速蒸发掉；固体物质只占1%，其中2/3是有机物质，如氨基酸、蛋白质、脂肪酸、尿素等；剩余1/3是无机物质。本发明以指 印中的氨基酸为检测物，制备了活化的三联吡啶钌复合物。它可以通过分子上的N-羟基琥珀酰亚胺酯与指印氨基酸中的氨基发生共价结合，从而标记并固定在指纹上。继而将标记好的样本安装在电化学反应池中，加入含共反应剂的反应溶液，施加一定电位，指纹上标记的三联吡啶钌复合物即可与溶液中的共反应剂发生电化学发光反应，从而显现出指纹的纹路。本发明基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法在电化学发光成像系统上实现。如图I和2所示，电化学发光成像系统包括电化学反应池I、恒电位控制仪2和CXD照相机3，电化学反应池I包括底座4和池体5，底座4上具有凹槽6，池体5中空，通过0型密封圈7和螺丝8固定在凹槽6上，池体5—侧有一小孔9。恒电位控制仪2包括工作电极10、对电极11和参比电极12，参比电极12安放在小孔9内，其中，工作电极为ITO (铟锡氧化物导电玻璃)，对电极为钼环，参比电极为Ag/AgCl电极或Ag电极。电化学反应池I的材质可以为聚四氟乙烯；但不限于此。本发明的方法包括以下步骤
I、电极预处理将工作电极10依次在丙酮、乙醇和去离子水中各超声清洗10-20min，再用去尚子水彻底冲洗干净，用IS气吹干。2、指印样本制备用胶带将不同客体上的指印提取下来，然后用适中力度转移到工作电极10上，形成指印样本；客体包括但不限于电脑屏、光盘、硬币、桌面和不锈钢器具。3、用活化的三联吡啶钌复合物标记指印将50 活化的三联吡啶钌复合物涂覆在指印样本上，盖上表面皿防止溶液挥发，在室温下反应30min以上，用去离子水冲洗样本以除去未反应的复合物，用氩气吹干。活化的三联吡啶钌复合物为N-羟基琥珀酰亚胺活化的三联吡啶钌，可依据文献(Biophysical Journal, 1995，68，342-350)合成，得到的终产物为该复合物的二甲基甲酰胺溶液，本步骤中，将其涂覆在指印样本上。4、电化学发光成像将上述处理的工作电极10、对电极11和参比电极12置于电化学反应池I中，然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池I中，恒电位控制仪2通电，CXD照相机3采集指纹图像。反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入50mmol 二正丁基乙醇胺和0. 15mol氯化钠组成，磷酸盐缓冲溶液的PH为7. 4。恒电位控制仪2的电位为I. 3V。下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
本发明是基于电化学发光标记物显现潜在指纹，将一枚指印用活化的三联吡啶钌复合物标记后，安装在如图2所示的电化学反应池中，按照图I所示组装成三电极体系，通过施加一定的电位，电极表面产生的电化学发光会被上方的高灵敏CCD照相机捕获，由此得到指印图像。实施例I
(1)在ITO上按一枚油潜指�。�
(2)用活化的三联吡啶钌复合物孵育4h，用去离子水冲洗以除去未反应的复合物；
(3)将样本安装在电化学反应池中，加入50mM二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液，通过三电极体系施加I. 3V电位，用高灵敏CCD照相机对图像进行捕获，得到图3所示的电化学发光图像。实施例2
(1)在ITO上按一枚油潜指�。�
(2)用活化的三联吡啶钌复合物孵育6h，用去离子水冲洗以除去未反应的复合物；
(3)将样本安装在电化学反应池中，加入50mM二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液，通过三电极体系施加I. 3V电位，用高灵敏CCD照相机对图像进行捕获，得到图4所示的电化学发光图像。实施例3
(1)在ITO上按一枚油潜指�。�
(2)然后用稀释两倍的活化的三联吡啶钌复合物孵育3.5h，用去离子水冲洗以除去未反应的复合物；
(3)将样本安装在电化学反应池中，加入50mM二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液，通过三电极体系施加I. 3V电位，用高灵敏CCD照相机对图像进行捕获，得到图5所示的电化学发光图像。实施例4
(1)在ITO上按一枚汗潜指�。�
(2)用活化的三联吡啶钌复合物孵育3.5h，用去离子水冲洗以除去未反应的复合物；
(3)将样本安装在电化学反应池中，加入50mM二正丁基乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液，通过三电极体系施加I. 3V电位，用高灵敏CCD照相机对图像进行捕获，得到图6所示的电化学发光图像。 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法，该方法在电化学发光成像系统上实现；电化学发光成像系统包括电化学反应池、恒电位控制仪和CCD照相机，电化学反应池包括底座和池体，底座上具有凹槽，池体中空，通过O型密封圈和螺丝固定在凹槽上，池体一侧有一小孔；恒电位控制仪包括工作电极、对电极和参比电极，参比电极安放在小孔内，其中，工作电极为ITO (铟锡氧化物导电玻璃)，对电极为钼环，参比电极为Ag/AgCl电极或Ag电极；其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)电极预处理将工作电极依次在丙酮、乙醇和去离子水中各超声清洗10-20min，再用去离子水彻底冲洗干净，用氩气吹干； (2)指印样本制备用胶带将不同客体上的指印提取下来，然后转移到工作电极上，形成指印样本； (3)用活化的三联吡啶钌复合物标记指印将50 活化的三联吡啶钌复合物涂覆在指印样本上，盖上表面皿防止溶液挥发，在室温下反应30min以上，用去离子水冲洗样本以除去未反应的复合物，用氩气吹干； (4)电化学发光成像将上述处理的工作电极、对电极和参比电极置于电化学反应池中，然后将含共反应剂的反应溶液加入电化学反应池中，恒电位控制仪通电，CCD照相机采集指纹图像；所述反应溶液由在每升磷酸盐缓冲溶液中加入50mmol 二正丁基乙醇胺和0.15mol氯化钠组成，磷酸盐缓冲溶液的pH为7. 4，恒电位控制仪的电位为I. 3V。
2.根据权利要求I所述基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述客体包括但不限于电脑屏、光盘、硬币、桌面和不锈钢器具。
3.根据权利要求I所述基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述活化的三联吡啶钌复合物为N-羟基琥珀酰亚胺活化的三联吡啶钌。
全文摘要
本发明公开了一种基于电化学发光标记物显现潜在指纹的方法，该方法用活化的三联吡啶钌复合物为电化学发光标记物，它可以通过分子上的N-羟基琥珀酰亚胺酯与指印氨基酸中的氨基发生共价结合，从而标记并固定在指纹上；继而在一定电位下与溶液中的共反应剂(二正丁基乙醇胺)发生电化学发光反应，从而显现出指纹的纹路，包括整体形貌(一级结构)和细节特征(二级结构)；本发明采用的电化学发光技术不需要外加激发光源、不存在背景光，且大大降低了发光剂的自猝灭现象，明显优于传统荧光成像法；该成像技术能够迅速获取图像，远远快于扫描电化学显微镜；使用的电化学发光共反应剂为二正丁基乙醇胺，它具有发光强度大、环境友好的特点。
文档编号G01N21/76GK102727213SQ20121020485
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者李妍, 苏彬, 许林茹 申请人:浙江大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
