专利名称：Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法、其中使用的试剂盒及使用其的癌判断方法
Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法、其中使用的试剂盒及使用其的癌判断方法
技术领域：
本发明涉及用于测定Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法及免疫测定用试剂盒。Ku86和其自身抗体的复合物特别是在患癌患者的血中以高值出现，从而，本发明不仅提供简单测定Ku86和其自身抗体的复合物的方法，还可在癌的判断中利用。
背景技术：
Ku86是与双链DNA切断相关的蛋白质，与Ku70 —同，形成被称为Ku的异源二聚体，该Ku异源二聚体与DNA依赖性蛋白激酶等共同可修复双链DNA切断(非专利文献I)另一方面，由向琼脂糖2 维电泳适用 2D-DIGE 法(two-dimensional fluorescencedifference gel electrophrosis)的改良琼脂糖2维电泳法(非专利文献2),通过蛋白质 组解析进行原发性肝细胞癌的癌部及周边的非癌部组织的表达蛋白的量的比较，得知被称为Ku86的蛋白质在癌部多表达(非专利文献3)现有技术文献非专利文献非专利文献I Li et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 9，No. 2，832-837，2002非专利文献2:Takeshi Tomonaga et al. ,Clin. Cancer Res. 2004 ； 10:2007-2014非专利文献3 :Masanori Seimiya et al. , Hepatology 2008 ；48:519-30
发明内容发明要解决的技术课题本发明人发现，通过测定疑似患癌的患者或癌患者来源的组织待测样品中存在的，Ku86的表达水平，可判别它们的组织的癌部和非癌部。本发明人再对血液待测样品中的Ku86的存在进行持续研究时，令人惊讶地发现，有在血液待测样品中存在Ku86和其自身抗体的复合物的情况，在癌患者的情况中，该复合物的量多。从而，本发明的目的是提供可应用于癌判断的，Ku86和其自身抗体的复合物的测定方法。解决课题的技术方案本发明人发现，可通过免疫测定待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物测定该复合物，由此使癌判断成为可能，从而完成本发明。从而，本发明涉及待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法，其特征在于，免疫测定待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物。再者，本发明涉及Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定用试剂盒，其含抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质。再者，本发明涉及癌判断方法，其通过测定Ku86和其自身抗体的复合物判断是癌。
再者，本发明涉及癌判断用标志物，其含Ku86和其自身抗体的复合物。发明效果在本发明中，可简单地测定待测样品中，特别是，血液来源待测样品中存在的Ku86和其自身抗体的复合物，对于原发性肝细胞癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌等的癌患者的判断有效。
图I是使用致敏抗Ku86抗体的ELISA板而测定健康人血清待测样品、C型肝炎患者血清待测样品、C型肝硬化患者血清待测样品、初发原发性肝细胞癌(以下，也称之为初发HCC)患者血清待测样品及再发原发性肝细胞癌(以下，也称之为再发HCC)患者血清待测样品中Ku86和其自身抗体的复合物结果。再有，图中，横轴示疾病名，纵轴示对波长450nm光的吸光度。另外，星号示，在进行与健康人血清待测样品组、C型肝炎患者待测样品组或C型肝硬化患者血清待测样品组的比较的全部的情况中，存在通过Wilcoxon的2标本检验 的显著差异(P < 0. 0001)的血清待测样品组。图2是使用致敏抗Ku86抗体的ELISA板而测定健康人血清待测样品、初发HCC患者血清待测样品、大肠癌患者血清待测样品、胃癌患者血清待测样品、胰腺癌患者血清待测样品、乳腺癌患者血清待测样品、肺癌患者血清待测样品及食道癌患者血清待测样品中Ku86和其自身抗体的复合物结果。再有，图中，横轴示疾病名，纵轴示对波长450nm光的吸光度。另外，星号示，进行与健康人血清待测样品组的比较的情况中，存在通过Wilcoxon的2标本检验的显著差异(p < 0. 0001)的血清待测样品组。实施方式本发明的Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法可直接，应用作为一般蛋白质和其抗体的免疫复合物的免疫测定方法已知的公知的方法。在本发明的免疫测定方法中，例如，可通过将抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，以及测定得到的复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物来测定该复合物。在本发明中，作为待测样品，以活体来源的样品为适宜，特别是，血液来源待测样品为适宜，作为血液待测样品，可例示全血、血浆、血清。本发明的免疫测定方法的测定对象是Ku86和其自身抗体的复合物。如上所述，Ku86是与双链DNA切断相关的蛋白质，其正式名是ATP-依赖性DNA解链酶2亚基2(ATP-dependent DNA helicase 2subunit 2)，作为别名，也称之为 XRCC5。另外，Ku86 是在美国的国立生物工程学信息中心(NCBI)的登录号(accession No)是gi_10863945的，由732个的氨基酸组成的82kDa的蛋白质。在本发明中，Ku86和其自身抗体的复合物，是指Ku86和抗Ku86自身抗体的免疫复合物，在本说明书中简单记作复合物。在本发明中，自身抗体是指针对自身的身体中存在的物质而由自身的身体产生的抗体，自身的身体中存在的物质是Ku86，则是指针对该Ku86的抗体。在本发明中，抗Ku86的试剂抗体是指与作为试剂使用的Ku86特异性地结合的抗体，在本说明书也简单记作试剂抗体。该试剂抗体，作为其产生动物种，有人、小鼠、大鼠、兔、山羊、马等，各自有指定范围的免疫球蛋白。该试剂抗体是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD之任何也可。另外，试剂抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、及这些的片段(是与抗原有结合能力的，例如，H链、L链、Fab、F (ab’)2等)之任何也可。这样的试剂抗体可以Ku86全长蛋白质或其片段肽作为抗原，给上述的产生动物种免疫，从该免疫动物作为抗血清获得，另 外，可将从免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，从融合细胞，筛选产生抗Ku86抗体的融合细胞，从得到的杂交瘤作为单克隆抗体获得。另外，抗Ku86的试剂抗体已作为抗Ku86抗体市售，使用它们的市售品也可。在本发明中，可结合其自身抗体的物质只要是可结合抗Ku86自身抗体的物质，就不特别限定，在本说明书中，可简单记作可结合物质。作为这样的可结合物质，可使用抗IgG抗体、蛋白A、蛋白G、作为试剂的Ku86抗原，其中，优选为抗IgG抗体。使用作为试剂的Ku86抗原时，只要是可与抗Ku86自身抗体发生抗原抗体反应的抗原，就不特别限定，作为Ku86全长蛋白质、Ku86全长蛋白质的变体，可例示有可和与该蛋白质同样的抗Ku86自身抗体发生抗原抗体反应的功能，并且与该氨基酸序列有90%以上的相同性的蛋白质，或有在Ku86全长蛋白质的氨基酸序列中I个至数个的氨基酸残基缺失、取代或附加的氨基酸序列的蛋白质的变体，作为Ku86的片段肽，可例示可与Ku86的自身抗体发生抗原抗体反应的肽。Ku86全长蛋白质可从Abnova公司得到,但由于全氨基酸序 列是已知的，所以Ku86全长蛋白质或其变体通过基因重组技术也可合成。本发明中，在使用Ku86的片段肽之时，通过将Ku86全长蛋白质用酶分解等，切断为各种的肽片段而制成也可，也可使用市售的自动肽合成装置容易地制成。另外，可将目标的Ku86的片段肽利用基因重组技术制成。可使如此得到的Ku86全长蛋白质的变体或片段肽与抗Ku86自身抗体反应而选择发生抗原抗体反应的，而当作作为试剂的Ku86抗原使用。在本发明中，除了上述的各肽片段的全体之外，也可使用其一部分，也可使用它们的混合物，这些也包含在作为试剂的Ku86抗原中。在本发明中，使抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，则生成复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物。 为了测定该免疫复合物，需将抗Ku86的试剂抗体(试剂抗体)及可结合其自身抗体的物质(可结合物质)之任何用标记成分标记，通过测定生成的免疫复合物中的标记成分来测定免疫复合物是优选的。作为标记成分，可使用酶、放射性物质、荧光物质、化学发光物质等常用的标记成分，优选为酶或放射性物质。作为用于标记的酶，适宜使用辣根过氧化物酶(HRP)、牛小肠碱性磷酸酶、￠-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等的酶联免疫分析法(EIA)中常用的酶，适合于这些酶而适宜使用在EIA中常用的发色底物。作为发色底物，例如在HRP的情况中，可使用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMBZ)、TMBZ .HCl、TMBZ -PSaBTSw-苯二胺、P-羟苯基醋酸等，在碱性磷酸酶的情况中，可使用P-硝基苯基磷酸酯、4-甲基伞形花酰磷酸酯等，在P -半乳糖苷酶的情况中，可使用O-硝基苯基-0-D-卩比喃半乳糖、4-甲基伞形花酰P-D-卩比喃半乳糖
坐寸o作为用于标记的放射性物质，可例示放射性碘原子等；作为荧光物质，可例示FITC或若丹明等；作为化学发光物质，可例示亮氨醇等。本发明中，当使用标记成分时，例如，优选为通过使结合于水不溶性载体的抗Ku86的试剂抗体作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，接下来，向其作用用标记成分标记的可结合其自身抗体的物质，生成复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物，测定结合于其免疫复合物的标记成分来测定该复合物。另外，可通过使结合可结合其自身抗体的物质的水不溶性载体作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，接下来，向其作用用标记成分标记的抗Ku86的试剂抗体，生成复合物和可结合物质和试剂抗体的免疫复合物，测定结合于该免疫复合物的标记成分来测定该复合物。水不溶性载体的制备可使用将蛋白质结合到固相面的已知的方法容易地进行。例如，作为固相化载体，通�？墒褂弥椤⑽濉⒐艿取Ｗ魑蛘庑┑墓滔嗝娼岷峡筀u86的试剂抗体的方法，可适宜利用物理吸附、化学结合等已知的固定化技术。使如此固相化的抗Ku86的试剂抗体与含Ku86和其自身抗体的复合物的待测样品接触，则复合物中的Ku86部分和试剂抗体结合。再者，对于其结合物，作用用标记成分标记 的可结合其自身抗体的物质(例如标记抗IgG抗体)，则生成复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物。结果，通过测定生成的免疫复合物中的标记成分，可测定待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物。与上述同样操作，使固相化载体与可结合Ku86的自身抗体的物质结合，使固相化的可结合物质与含Ku86和其自身抗体的复合物的待测样品接触，使复合物中的自身抗体部分和可结合物质结合，再者，对该结合物，作用用标记成分标记的抗Ku86的试剂抗体(例如，抗Ku86抗体)，生成复合物和可结合物质和试剂抗体的免疫复合物，同样操作，测定待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物也可。接下来示本发明的免疫测定方法的典型例。向板加抗Ku86抗体，低温例如于4°C静置而致敏，其后，用PBS等的清洗液清洗。接下来，将该板用BSA包被，制成抗Ku86抗体ELISA板。将稀释的待测样品加入抗Ku86抗体ELISA板，加温例如于37°C静置，接下来用PBS等的清洗液清洗。向得到的板的孔加入HRP标记的抗人IgG抗体，加温例如于37°C静置。接下来，将孔用PBS等的清洗液清洗之后，力口TMBZ，例如于室温静置之后，作为反应停止剂加IN硫酸。吸光度使用酶标仪(BioRad公司制)，在波长450nm测定吸光度。由吸光度的值和预先制成的标准曲线，求出Ku86和其自身抗体的复合物的值。本发明的测定方法可由含抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质的，Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定用试剂盒实施。因此的抗Ku86的试剂抗体、可结合其自身抗体的物质如在本发明的测定方法中所说明。即，例如，可以将抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质之任何结合于水不溶性载体的形态，将另一方用标记成分标记的形态，作为试剂盒的试剂成分。作为其他试剂成分，适宜加表面活性剂、缓冲剂等的免疫测定法中常用的也可。在本发明中，通过测定Ku86和其自身抗体的复合物，可判断癌。另外，一般而言，Ku86和其自身抗体的复合物的量多，则疑似为原发性肝细胞癌(原发性肝细胞癌、原发性胆管细胞癌等)、转移性肝癌等的肝癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌等的癌，通过本发明的测定方法测定抗Ku86自身抗体对于患者的癌疾病的判别有效。本发明的测定方法的利用对于选自原发性肝细胞癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌的癌的判别特别有效。例如，对于健康人和，初发原发性肝细胞癌患者、再发原发性肝细胞癌患者、大肠癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者或食道癌患者的判别有效。另外，通过利用本发明的测定方法，使得C型肝炎患者或C型肝硬化等的肝脏疾病患者，和初发原发性肝细胞癌患者或再发原发性肝细胞癌患者等的原发性肝细胞癌患者的判别成为可能。如通过以上说明明了，Ku86和其自身抗体的复合物成为癌判断用标志物，例如，可作为原发性肝细胞癌(原发性肝细胞癌、原发性胆管细胞癌等)、转移性肝癌等的肝癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌等的癌的判断用标志物使用。另外，Ku86和其自身抗体的复合物作为使用全血、血浆、血清等的血液来源待测样品而判断癌的标志物也适宜。
实施例以下，通过实施例再详细地说明本发明，本发明不受这些实施例的任何限制。实施例I:Ku86和其自身抗体的复合物的测定如接下来具体说明对于从健康人、C型肝炎患者、C型肝硬化患者、初发原发性肝细胞癌患者、再发原发性肝细胞癌患者、大肠癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者及食道癌患者采集的血清待测样品，进行Ku86和其自身抗体的复合物的测定。I.方法(I)抗Ku86抗体ELISA板的制成在ELISA板(Nunc公司制，Maxisorp)中于4°C静置I晚作为抗Ku86抗体的抗XRCC5 抗体(Abnova 公司制，5 u g/ml, 100 u L/ 孔)而致敏，其后，用含 0. 05%Tween20 的 PBS(200 u L/孔)进行3次清洗。接下来，用含I. 5%BSA、10%蔗糖的PBS (200 u L/孔)包被I晚，从而制成抗Ku86抗体ELISA板。(2) Ku86和其自身抗体的复合物的测定作为检测抗体，使用将HRP标记的抗人IgG抗体(Zymed公司制)用含0. 05%Tween20的PBS稀释4000倍的。将样品血清用PBS稀释100倍。将该稀释的样品以各100 u L/孔加入抗Ku86抗体ELISA板，于37°C静置I小时，其后，用含0. 05%Tween20的PBS (200 UL/孔)进行3次清洗。向得到的板的孔以各100 UL/孔加稀释的HRP标记的抗人IgG抗体，于37°C静置30分钟。接下来，用含0. 05%Tween20的PBS (200iiL/孔)清洗3次之后，加各100 u L/孔TMBZ，于室温静置10分钟之后，作为反应停止剂加100 u L/孔的IN硫酸。使用酶标仪(BioRad公司制),在波长450nm进行测定吸光度。再有，待测样品使用健康人48例、C型肝炎患者19例、C型肝硬化患者18例、初发原发性肝细胞癌患者待测样品32症例、再发原发性肝细胞癌患者27例、大肠癌患者待测样品16例、胃癌患者16例、胰腺癌患者16例、乳腺癌患者16例、肺癌患者16例、食道癌患者16例。2.结果将使用测定Ku86和其自身抗体的复合物结果的结果示于图I及图2。使用KaleidaGraph4. 0,用Wilcoxon的2标本检验进行统计处理而进行显著差异检验。
如图I所示，与健康人组、C型肝炎组及C型肝硬化组比较，确认初发原发性肝细胞癌患者待测样品组及再发原发性肝细胞癌患者待测样品组的Ku86和其自身抗体的复合物量明显具有显著差异。从而，血中的Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定，在肝脏疾病之中，示对于原发性肝细胞癌的判别特别有效。如图2所示，与健康人组比较，确认各种癌患者待测样品组、S卩，初发原发性肝细胞癌患者待测样品组、大肠癌患者待测样品组、胃癌患者待测样品组、胰腺癌患者待测样品组、乳腺癌患者待测样品组、肺癌患者待测样品组及食道癌患者待测样品组的Ku86和其自身抗体的复合物量具有明显显著差异。从而，血中的Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定，在各种的癌中，示对于健康者和癌患者的判别有效。工业实用性如以上详细地说明，可通过将抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质作用于血液来源待测样品等的待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，以及测定得到的复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物来测定该复合物，由此，原发性肝细胞癌、大 肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌等的癌判断成为可能。
权利要求
1.待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定方法，其特征在于，免疫测定待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物。
2.权利要求I所述的免疫测定方法，其中通过将抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，以及测定得到的复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物来测定该复合物。
3.权利要求2所述的免疫测定方法，其中试剂抗体及可结合物质之任何被标记成分标记,通过测定免疫复合物中的标记成分而测定免疫复合物来测定复合物。
4.权利要求3所述的免疫测定方法，其中通过 使结合于水不溶性载体的抗Ku86的试剂抗体作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，接下来， 向其作用用标记成分标记的可结合其自身抗体的物质， 生成复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物， 测定结合于其免疫复合物的标记成分 来测定该复合物。
5.权利要求2 4之任一项所述的免疫测定方法，其中可结合其自身抗体的物质是抗IgG抗体。
6.权利要求3 5之任一项所述的免疫测定方法，其中标记成分是酶或放射性物质。
7.权利要求I 6之任一项所述的免疫测定方法，其用于癌判断。
8.权利要求7所述的免疫测定方法，其中癌是原发性肝细胞癌。
9.权利要求I 8之任一项所述的免疫测定方法，其中待测样品是血液来源待测样品。
10.Ku86和其自身抗体的复合物的免疫测定用试剂盒，其含抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质。
11.癌判断方法，其中通过测定Ku86和其自身抗体的复合物来判断是癌。
12.权利要求11所述的癌判断方法，其中测定血液来源待测样品中的复合物。
13.权利要求12所述的癌判断方法，其中癌是选自下列的癌原发性肝细胞癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌。
14.癌判断用标志物，其包含Ku86和其自身抗体的复合物。
15.权利要求14所述的癌判断用标志物，其用于使用血液来源待测样品来判断。
16.权利要求14所述的癌判断用标志物，其中癌是选自下列的癌原发性肝细胞癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌。
全文摘要
本发明可通过将抗Ku86的试剂抗体及可结合其自身抗体的物质作用于待测样品中的Ku86和其自身抗体的复合物，以及测定得到的复合物和试剂抗体及可结合物质的免疫复合物来测定该复合物，由此，可判断是原发性肝细胞癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及食道癌等之任何的癌。
文档编号G01N33/574GK102753973SQ20118000894
公开日2012年10月24日 申请日期2011年2月7日 优先权日2010年2月12日
发明者小岛良, 曾川一幸, 清宫正德, 野村文夫, 野田健太 申请人:日东纺绩株式会社
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