亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：基于有机染料-量子点复合物的pH比率荧光探针的制法的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制备方法。
背景技术：
pH值的精确测量对于生理学、药物学、环境学、生物学、化学等体系的研究具有重要意义，化学反应的进行或完成、细胞和细胞器的许多重要过程都与PH密切相关。现有的PH测定方法主要有电极法、指示剂法和荧光光谱法。电极法一般使用玻璃电极，由于存在电化学的干扰，可能的机械磨损等缺陷而不适用于活体的PH检测。指示剂法一般使用酚酞、百里酚等PH指示剂，因显色范围宽，致使检测灵敏度和准确度低。荧光光谱法是一种基于光学信号而建立的检测方法，相比前两种方法，PH荧光探针具有化学/光稳定性好、灵敏度高，选择性好，响应快、适当的脂溶性和水溶性，对细胞毒害作用小，可进行快速、实时、原位 检测等优点，受到很高的重视。现有的研究中，普遍将单一的有机染料发展为pH荧光探针，其荧光性质随pH的变化可用来指示目标介质中酸碱性的改变，但此类PH测定法，易受光漂白、探针分子浓度、探针分子微环境(如极性、pH、温度、仪器等)、光化学稳定性等因素的影响，进而干扰准确的定性与定量。为了克服以上缺陷，引入了比率荧光法，即加入第二个发色团以形成双发射的荧光探针体系，避免了试剂浓度下的荧光波动和背景荧光的干扰。基于此，pH比率荧光探针的研究引起了科研工作者的广泛兴趣。相比有机染料，胶体半导体纳米晶(或称为量子点QDs)具有荧光质量高，激发光谱宽，发射光谱尺寸可调，量子产率高和光化学稳定性好等优点，使QDs荧光探针产生出显著的靶向信号用于各种物质的定性和定量分析。截至目前，有关PH比率荧光探针的制备方法已有中国专利报道(公开号CN101993693A)，其中涉及了两种有机染料分子和介孔二氧化硅模板，该探针的合成存在相对复杂、比较耗时、成本较高等问题，进而影响了其实际的应用价值。因此，获得一种集灵敏度高、方法简单、价格低廉等优点于一体的PH探针体系已成为一项重要的研究课题，这也是亟待解决的关键技术问题。迄今为止，尚未见基于半导体量子点的pH比率突光探针，以及基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的相关专利报道。

发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单，快速、成本低的基于有机染料-量子点复合物的pH比率突光探针的制法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种基于有机染料-量子点复合物的pH比率荧光探针的制法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤(I)在N2气氛，磁力搅拌及碱性水溶液中，氯化镉、碲氢化纳、巯基乙酸三者反应回流3 6小时，制备出巯基乙酸稳定的碲化镉量子点CdTe QDs ；
(2)在室温和磁力搅拌下，将聚乙烯亚胺PEI水溶液逐滴加入碲化镉量子点CdTeQDs溶液中，形成阳离子聚电解质聚乙烯亚胺PEI静电吸附的碲化镉量子点QDs ；(3)然后逐滴加入异硫氰酸荧光素FITC水溶液，以静电吸附的方式形成碲化镉异硫氰酸荧光素复合物(CdTe-FITC复合物)，并将其分散在磷酸缓冲液中(PBS，pH = 6 7)； (4)采用荧光光谱法测定碲化镉异硫氰酸荧光素复合物中FITC与QDs的特征荧光峰强度比IFITC/IMTe，并拟合其与PH之间的关系，构建出基于该复合物的pH比率荧光探针。步骤(I)中所述的碱性水溶液是用IM的NaOH溶液调节pH为10 12，碲氢化纳、氯化镉、巯基乙酸三者的摩尔比为I : 2 : 4 I : 10 : 20，碲化镉量子点最大荧光发射峰波长为550 600nm。 步骤(2)中所述的聚乙烯亚胺在碲化镉量子点水溶液中的质量分数为O. I %。步骤(3)中所述的异硫氰酸突光素最大突光发射峰波长为520nm,异硫氰酸突光素与阳离子聚电解质聚乙烯亚胺静电吸附的碲化镉量子点的摩尔比为I : I 4 : I。步骤(3)中所述的磷酸缓冲液的pH 6 7。步骤(4)中所述的pH范围为5. 8 8. 7，碲化镉异硫氰酸荧光素复合物中的特征荧光峰强度比IFITC/IMTe与pH之间的呈线性关系。所述的线性关系可应用于人体细胞膜模拟样品(脂质体)溶液中pH的比率荧光探测。本发明的效果是选用CdTe QDs作为主要的荧光源，引入FITC作为辅助(或参比)发色团，以静电吸附自组装的方式形成FITC-CdTe复合物的双发射(比率)荧光探针，克服了传统单强度基探针的荧光信号难以准确获得的难题。与现有技术相比，本发明方法简单，快速、成本低，制备产物可对生物样品和复杂体系中的PH进行准确、灵敏、简便、快捷的探测，为生物检测、化学分析等领域的研究提供了一种新的发展方向。


图I为基于FITC-CdTe复合物的pH比率荧光探针的制备过程示意图；图2为FITC-CdTe复合物溶液随pH(5. 3 8. 7)演化的荧光发射光谱，其中的FITC、CdTe QDs摩尔浓度和激发波长分别为40nM、20nM和470nm ；图3为采用本发明比率荧光探针方法(即IFnc/IcdTe或I52Q/I595与PH间的线性关系)测定脂质体溶液(ImM)中的pH，具体为设定的PH1与测定的pH2之间的关系及其线性拟合。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例I基于FITC-CdTe复合物的pH比率荧光探针的制备过程参见图1，详细的制备步骤如下首先采用超纯水配置巯基乙酸稳定的CMTe QDs溶液(50nM),即在N2气氛,磁力搅拌及碱性水溶液中，氯化镉、碲氢化纳、巯基乙酸三者按摩尔比为I : 2 4混合，并通过IM的NaOH溶液调节pH为10 12，反应回流3 6小时，制备出巯基乙酸稳定的碲化镉量子点(CdTe QDs)，称取一定量聚乙烯亚胺(PEI)溶于超纯水，质量分数调节为1%。然后在室温与缓慢磁力搅拌下，将PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通过静电吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩尔浓度与PEI质量分数分别控制为40nM与O. I %。接下来称取一定量FITC溶于超纯水，浓度调节为80nM，在室温和缓慢磁力搅拌下，将FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以静电吸附的方式形成FITC-QDs复合物，其中的QDs与FITC摩尔浓度分别为30nM与60nM。最后采用IOmM磷酸缓冲液(PBS)调节复合物溶液pH，以获得一系列具有不同pH的复合物样品，其中的pH分别调节为5. 3,5. 9,6. 5,7. 0,7. 4,8. O和8. 7，QDs与FITC摩尔浓度分别为20nM与40nM。采用荧光光谱法测定每个复合物样品的荧光发射光谱，所有待测样品须在暗室孵化十分钟，以使荧光增强反应达到稳定，激发波长均为470nm，取6次测量的平均值为最终结果，参见图2。配置一系列脂质体的PBS溶液，其中的脂质体与PBS的摩尔浓度分别设定为ImM与IOmM, pH分别调节为5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O和8. 5，然后在室温与缓慢磁力搅拌下加入等体积的复合物溶液，以形成均质的脂质体-复合物样品溶液。采用本发明探针方法(即IFITC/IMTe与PH的线性关系)测定每个样品的荧光发射光谱，并对测定的PH与设定的 PH进行拟合，以检验本发明pH比率荧光探针在生物样品或复杂体系中的实际分析能力，参见图3。实施例2首先采用超纯水配置巯基乙酸稳定的CMTe QDs溶液(50nM),即在N2气氛,磁力搅拌及碱性水溶液中，氯化镉、碲氢化纳、巯基乙酸三者按摩尔比为I : 10 20混合，并通过IM的NaOH溶液调节pH为IO 12，反应回流3 6小时，制备出巯基乙酸稳定的碲化镉量子点(CdTe QDs)，称取一定量聚乙烯亚胺(PEI)溶于超纯水，质量分数调节为1%。然后在室温与缓慢磁力搅拌下，将PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通过静电吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩尔浓度与PEI质量分数分别控制为40nM与O. I %。接下来称取一定量FITC溶于超纯水，浓度调节为80nM，在室温和缓慢磁力搅拌下，将FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以静电吸附的方式形成FITC-QDs复合物，其中的QDs与FITC摩尔浓度分别为30nM与60nM。最后采用IOmM磷酸缓冲液(PBS)调节复合物溶液pH，以获得一系列具有不同pH的复合物样品，其中的pH分别调节为4. 9,5. 3,5. 5,5. 9,6. 0,6. 5,7. 0,7. 4,7. 5,8. O、
8.3,8. 5和8. 7，QDs与FITC摩尔浓度分别为20nM与40nM。所有样品须在暗室孵化十分钟，以使荧光增强反应达到稳定，然后采用荧光光谱法依次测定每个样品的荧光发射光谱，激发波长均为470nm，取6次测量的平均值为最终结果。配置一系列脂质体的PBS溶液，其中的脂质体与PBS的摩尔浓度分别设定为ImM与IOmM, pH分别调节为5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5和9. 0，然后在室温与缓慢磁力搅拌下加入等体积的复合物溶液，以形成均质的脂质体-复合物样品溶液。采用本发明探针方法(即IFITC/IMTe与PH的线性关系)测定每个样品的荧光发射光谱，并对测定的PH与设定的PH进行拟合，以检验本发明pH比率荧光探针在生物样品或复杂体系中的实际分析能力。实施例3首先采用超纯水配置巯基乙酸稳定的CdTe QDs溶液(IOOnM)，称取一定量聚乙烯亚胺(PEI)溶于超纯水，质量分数调节为1%。然后在室温与缓慢磁力搅拌下，将PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通过静电吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩尔浓度与PEI质量分数分别控制为80nM与O. 1%。接下来称取一定量FITC溶于超纯水，浓度调节为150nM，在室温和缓慢磁力搅拌下，将FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以静电吸附的方式形成FITC-QDs复合物，其中的QDs与FITC摩尔浓度分别为60nM与120nM。最后采用IOmM磷酸缓冲液(PBS)调节复合物溶液pH，以获得一系列具有不同pH的复合物样品，其中的pH分别调节为5. 3,5. 9,6. 5,7. 0,7. 4,8. O和8. 7，QDs与FITC摩尔浓度分别为40nM与80nM。所有样品须在暗室孵化十分钟，以使荧光增强反应达到稳定，然后采用荧光光谱法依次测定每个样品的荧光发射光谱，激发波长均为470nm，取6次测量的平均值为最终结果。配置一系列脂质体的PBS溶液，其中的脂质体与PBS的摩尔浓度分别设定为2mM与IOmM, pH分别调节为5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O和8. 5，然后在室温与缓慢磁力搅拌下加入等体积的复合物溶液，以形成均质的脂质体-复合物样品溶液。采用本发明探针方法(即IFITC/IMTe与PH的线性关系)测定每个样品的荧光发射光谱，并对测定的PH与给定的PH进行拟合，以检验本发明pH比率荧光探针在生物样品或复杂体系中的实际分析能力。实施例4·首先采用超纯水配置巯基乙酸稳定的CdTe QDs溶液(IOOnM)，称取一定量聚乙烯亚胺(PEI)溶于超纯水，质量分数调节为1%。然后在室温与缓慢磁力搅拌下，将PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通过静电吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩尔浓度与PEI质量分数分别控制为80nM与O. 1%。接下来称取一定量FITC溶于超纯水，浓度调节为150nM，在室温和缓慢磁力搅拌下，将FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以静电吸附的方式形成FITC-QDs复合物，其中的QDs与FITC摩尔浓度分别为60nM与120nM。最后采用IOmM磷酸缓冲液(PBS)调节复合物溶液pH，以获得一系列具有不同pH的复合物样品，其中的pH分别调节为 4. 9,5. 3,5. 5,5. 9,6. 0,6. 5,7. 0,7. 4,7. 5,8. 0,8. 3,8. 5 和 8. 7，QDs 与 FITC 摩尔浓度分别为40nM与80nM。所有样品须在暗室孵化十分钟，以使荧光增强反应达到稳定，然后采用荧光光谱法测定每个样品的荧光发射光谱，激发波长均为470nm，取6次测量的平均值为最终结果。配置一系列脂质体的PBS溶液，其中的脂质体与PBS的摩尔浓度分别设定为2mM与IOmM, pH分别调节为5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5和9. 0，然后在室温与缓慢磁力搅拌下加入等体积的复合物溶液，以形成均质的脂质体-复合物样品溶液。采用本发明探针方法(即IFITC/IMTe与PH的线性关系)测定每个样品的荧光发射光谱，并对测定的PH与设定的PH进行拟合，以检验本发明pH比率荧光探针在生物样品或复杂体系中的实际分析能力。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤 (1)在N2气氛，磁力搅拌及碱性水溶液中，氯化镉、碲氢化纳、巯基乙酸三者反应回流3 6小时，制备出巯基乙酸稳定的碲化镉量子点； (2)在室温和磁力搅拌下，将聚乙烯亚胺水溶液逐滴加入碲化镉量子点溶液中，形成阳离子聚电解质聚乙烯亚胺静电吸附的碲化镉量子点； (3)然后逐滴加入异硫氰酸荧光素水溶液，以静电吸附的方式形成碲化镉异硫氰酸荧光素复合物，并将其分散在磷酸缓冲液中； (4)采用荧光光谱法测定碲化镉异硫氰酸荧光素复合物中异硫氰酸荧光素与碲化镉量子点的特征荧光峰强度比ΙΡΙΤ。/〗。-，并拟合其与PH之间的关系，构建出基于该复合物的pH比率荧光探针。
2.根据权利要求I所述的一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，步骤(I)中所述的碱性水溶液是用IM的NaOH溶液调节pH为10 12，碲氢化纳、氯化镉、巯基乙酸三者的摩尔比为I : 2 : 4 I : 10 : 20，碲化镉量子点最大荧光发射峰波长为550 600nm。
3.根据权利要求I所述的一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，步骤(2)中所述的聚乙烯亚胺在碲化镉量子点水溶液中的质量分数为O.1%。
4.根据权利要求I所述的一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，步骤(3)中所述的异硫氰酸荧光素最大荧光发射峰波长为520nm，异硫氰酸荧光素与阳离子聚电解质聚乙烯亚胺静电吸附的碲化镉量子点的摩尔比为I:I 4 I。
5.根据权利要求I所述的一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，步骤(3)中所述的磷酸缓冲液的pH 6 7。
6.根据权利要求I所述的一种基于有机染料-量子点复合物的PH比率荧光探针的制法，其特征在于，步骤(4)中所述的pH范围为5. 8 8. 7，碲化镉异硫氰酸荧光素复合物中的特征荧光峰强度比IFITC/IMTe与PH之间的呈线性关系。
7.根据权利要求6所述的一种基于有机染料-量子点复合物的pH比率荧光探针的制法，其特征在于，所述的线性关系可应用于人体细胞膜模拟样品溶液中PH的比率荧光探测。
全文摘要
本发明涉及基于有机染料-量子点复合物的pH比率荧光探针的制法，该方法具体包括以下步骤首先采用聚乙烯亚胺对巯基乙酸稳定的量子点(CdTe)进行修饰，然后利用静电相互作用将异硫氰酸荧光素(FITC)吸附在量子点表面，以静电吸附的层层自组装方式获得FITC-CdTe复合物。其中，该复合物的荧光特征峰强度比率IFITC/ICdTe(或对应为I520/I595)与pH呈线性关系，可发展为一种新型的pH比率荧光探针。与现有技术相比，本发明方法简单，成本较低，发明探针的灵敏性高，可作为一种新型的比率荧光探针用于生物样品和复杂体系pH的高效探测，对于发展其它类型的高质量荧光探针具有重要的参考价值。
文档编号G01N21/64GK102863964SQ20121039600
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者万锕俊, 桂日军, 李慧丽, 金辉 申请人:上海交通大学