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专利名称：农药环境污染诊断速测卡及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种环境污染速测卡及其制造方法，尤其是一种水环境和无公害农产品中有机磷、氨基甲酸酯类农药污染诊断速测卡及其制造方法。属于诊断检测用品领域。
背景技术：
有机磷和氨基甲酸酯类农药是农业上长期使用并对人与动物毒性较强的2类常规农药。随着人们生活水平的提高，环境中农药的残留，尤其是上述两类杀虫剂的残毒问题受到了普遍关注，传统的农残检测法(气相和液相色谱法)具有仪器投资大、测试时间长、成本高等缺点，因此，国内外一些学者积极研究和开发用于现场农药残留快速检测的新技术和新方法。农药速测卡是一种运用胆碱酯酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的一种现场快速检测方法。速测卡法的优点在于简便、快捷，操作无需培训，工作效率高、节省人力物力，但目前国产速测卡的缺点在于，反应后的颜色浅，有时不容易判断。
经文献检索发现，1990年《环境科学学报》第10卷第1期《农药残毒速测箱的研制和应用》报道了李治祥等人开发的农药残留速测箱，该速测箱中除装有酶片、显色基质片以外，还有装有烧杯、塑料管、玻璃棒等，可用于快速检测蔬菜、水果、粮食及水中的有机磷或氨基甲酸酯类农药，但是该速测箱的显色基质片水溶性较差，使用时需以手挤捏促进溶解。国外报道使用的显色基质片也常存在稳定性等问题。

发明内容
本发明的目的是针对背景技术的不足，提供一种农药环境污染诊断速测卡及其制造方法，尤其是涉及水环境和无公害农产品中有机磷、氨基甲酸酯类农药污染诊断速测卡及其制造方法，使用这种诊断速测卡，可实现判定结果的及时准确，可靠性、重复性好，从而解决了背景技术中的不足。
本发明的技术方案是这样实现的，本发明农药环境污染诊断速测卡，诊断区、反应区、生色片和基质片组成，可人工折叠、重合，诊断区在上，反应区在下，诊断区用透明塑料、反应区用特种纸制成，诊断区上载有多片含有固化酶的生色片，其中一个用于参比样品检测，其余则用于可疑样品检测，反应区上对应地载有同样数量的基质片。各生色片、基质片之间均有易撕条，诊断区、反应区上均设有卡口，生色片大小稍大于基质片。速测卡的形状包括长方形、正方形、圆形、椭圆形等任何几何形状。
实施检测时，在诊断区同时滴加多个可疑样品，1个参比样品，3分钟后，诊断区和反应区紧密接触，当诊断区对照样品变色时，观测比较可疑样品的颜色变化，不变色的为阳性样品，否则为阴性样品。
本发明农药环境污染诊断速测卡的制备方法，其步骤如下1、生色片的制备本发明所用酶源为昆虫匀浆液或动物血清中的乙酰胆碱酯酶。酶的固定化采用交联法，用双功能团试剂(如戊二醛)、牛血清白蛋白和磷酸缓冲液把酶固定到合适的载体上。将物理吸附载体裁成圆片，在4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸缓冲溶液、双功能试剂、载体蛋白混合，加入物理吸附载体，浸泡15分钟，然后，取出载体，置于小型通风橱中阴干，即为生色片。
其中加入的乙酰胆碱酯酶与载体的比例为1～5U/片，加入的双功能团试剂(如戊二醛)与载体的比例为0.2～0.5μl/片，加入的载体蛋白(如牛血清白蛋白)与载体的比例为1～3μl/片。本发明所用载体包括尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜或滤纸，优先使用滤纸。使用尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜为物理吸附载体时还需增加载体预处理、洗涤保存两个步骤。
2、基质片的制备将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液浓度为400～800mg/l，然后，把物理吸附载体放入该溶液中，浸泡15分钟，置于小型通风橱中阴干，即为基质片。
3、将上述生色片和基质片分别对应地固定在诊断速测卡的诊断区和反应区上，再将成型的15张诊断速测卡和1瓶提取液放入包装盒内即可。
本发明制备的酶片活性高、稳定性好，特别是在速测卡的结构设计上，采用透明的诊断区，加上参比样品和可疑样品合二为一的独特构思，实现了反应过程的实时观察，反应色差明显，结果判定容易，假阳性、假阴性发生率明显减少。
乙酰胆碱酯酶是一种蛋白催化剂，通常需要在低温下保存，试验证明，保存在0～5℃冰箱中的酶液，1周后活性降低30～50％。当酶活性降低或失去时，酶不能与底物结合而被水解，检测结果会出现负抑制率。而速测卡是将酶和底物显色剂固化在纸片上，干燥后密封，在4℃冰箱中放置1年多后，酶活性和检测灵敏度测定结果证明，重现性仍很好，几乎和储藏前完全相同。
本发明的诊断速测卡稳定性、重复性好、并且不需要特殊仪器，能快速多样品同时准确诊断出水环境、无公害农产品中的有机磷、氨基甲酸酯类农药污染情况，费用低廉，操作简便、易学，短时间内就能判读结果，可满足现场诊断要求，适合于无公害农产品生产基地、环境检测站大规模检测使用，也适合于农药生产厂家、个体经营户和家庭、菜场自查，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会和生态效益。


图1为本发明结构示意图。
图2为本发明设有三个基质片的结构示意图。
具体实施例方式
如图1和图2所示，本发明农药环境污染诊断速测卡由诊断区1、反应区2、生色片3和基质片4组成，诊断区在上，反应区在下，可人工折叠。诊断区1用透明塑料、反应区2用特种纸制成，诊断区1上载有多片生色片3，其中一个用于参比样品检测，其余则用于可疑样品检测。反应区2上对应地载有同样数量的基质片4，各生色片3、基质片4之间均有易撕条，诊断区1、反应区2上均设有卡口5，生色片3的大小稍大于基质片4。速测卡的形状包括长方形、正方形、圆形、椭圆形等任何几何形状。
如图1所示，本发明农药环境污染诊断速测卡包括诊断区1、反应区2、两个生色片3、两个基质片4和卡口5，生色片3固定在诊断区中，基质片4固定在反应区中，诊断区1和反应区2设有标记以示区别，可测试一个样品。
如图2所示，与图1中不同之处在于反应区2设有三个基质片，诊断区1设有三个生色片，可同时测试两个样品。
以下通过具体实施例对本发明方法作进一步的详细描述。
实施例一将滤纸裁成直径为1Cm和1.5Cm的两种小圆片，分别用于制作生色片和基质片，在4℃以下将乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分别按1U/片、0.2μl/片、1μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入载体滤纸，浸泡15分钟后，取出并置于小型通风橱中阴干，即为生色片。制作基质片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为400mg/l，载体浸泡时间为15分钟后，置于小型通风橱中阴干。将上述生色片和基质片各两片分别对应地固定在诊断速测卡的诊断区和反应区上，并把成型的15张诊断速测卡和1瓶提取液放入包装盒内即可。
实施例2将滤纸裁成直径为1Cm和1.5Cm的两种小圆片，分别用于制作生色片和基质片在4℃以下将乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分别按3U/片、0.4μl/片、2μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入载体滤纸，浸泡15分钟后，取出并置于小型通风橱中阴干，即为生色片。制作基质片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为600mg/l，载体浸泡时间为15分钟后，置于小型通风橱中阴干。将上述生色片和基质片各两片分别对应地固定在诊断速测卡的诊断区和反应区上，并把成型的15张诊断速测卡和1瓶提取液放入包装盒内即可。
实施例3将滤纸裁成直径为1Cm和1.5Cm的两种小圆片，分别用于制作生色片和基质片在4℃以下将乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白分别按5U/片、0.5μl/片、3μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入载体滤纸，浸泡15分钟，然后，取出载体，置于小型通风橱中阴干，即为生色片。制作基质片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为800mg/l，载体浸泡时间为15分钟后，置于小型通风橱中阴干。将上述生色片和基质片各两片分别对应地固定在诊断速测卡的诊断区和反应区上，并把成型的15张诊断速测卡和1瓶提取液放入包装盒内即可。
实施效果1、样品处理表面测定法擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴提取液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦，将蔬菜上的液滴滴在速测卡的诊断区生色片上，放置10min后，诊断区和反应区紧密接触。
整体测定法选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成0.5cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10ml提取液，振摇50次，静置2min以上，即为待检液，将2滴待测液滴在速测卡的诊断区生色片上，放置10min后，诊断区和反应区紧密接触。
环境水样测定取待测水样2滴直接滴在速测卡的诊断区生色片上，放置10min后，诊断区和反应区紧密接触。
当诊断区上含有参比样品的生色片变色时，观测比较可疑样品生色片的颜色变化，不变色的为阳性样品，否则为阴性样品。
2、农产品中农药残留检测取自上海三个批发市场的青菜、空心菜、生菜、黄瓜等样品共25份，编号为1～25，取温室试验青菜样品2份，编号为26、27号。用前述三种方法进行检测，结果除20、26、27号样品为阳性样品外，其余均为阴性样品。用气相色谱法检测，20号样品检出甲胺磷0.8ppm，26号样品乐果1.2ppm，27号样品呋喃丹0.5ppm，其余样品均未检出。
3、水中农药残留检测取自江苏苏州市郊鱼塘水3份，农田水样1份，编号为1、2、3、4号。用前述三种方法进行检测，结果1、2、3号为阴性，4号为阳性，用高效液相色谱检测，4号样品检出甲胺磷3.12ppm，1、2、3号样品未检出。
上述实例说明，本发明农药环境污染诊断速测卡与实验室色谱分析法有很好的相关性，而且方法的正确度和灵敏度也能达到环境安全的要求，因此，本发明的环境污染诊断速测卡将有广阔的应用前景。
权利要求
1.一种农药环境污染诊断速测卡，包括生色片(3)、基质片(4)，其特征在于还包括诊断区(1)、反应区(2)，诊断区(1)用透明塑料、反应区(2)用纸制成，诊断区(1)在上，反应区(2)在下，诊断区(1)上载有多片生色片(3)，反应区(2)上对应地载有同样数量的基质片(4)，诊断区(1)、反应区(2)上均设有卡口(5)，各生色片(3)、基质片(4)之间均有易撕条，生色片(3)大小稍大于基质片(4)。
2.根据权利要求1所述的农药环境污染诊断速测卡，其特征是，速测卡的形状包括长方形、正方形、圆形和椭圆形。
3.一种农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征在于，方法步骤如下(1)生色片的制备采用酶源为昆虫匀浆液或动物血清中的乙酰胆碱酯酶，酶的固定化采用交联法，用双功能团试剂、牛血清白蛋白和磷酸缓冲液把酶固定到载体上，即为生色片；(2)基质片的制备将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，然后，把物理吸附载体放入该溶液中浸泡，置于小型通风橱中阴干，即为基质片；(3)将上述生色片和基质片分别对应地固定在诊断速测卡的诊断区和反应区上，再将成型的诊断速测卡和提取液放入包装盒内即可。
4.根据权利要求3所述的农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征是，所述的步骤(1)，具体如下将物理吸附载体裁成圆片，在4℃以下将乙酰胆碱酯酶、磷酸缓冲溶液、双功能试剂、载体蛋白混合，加入物理吸附载体，浸泡15分钟，然后，取出载体，置于小型通风橱中阴干，即为生色片。
5.根据权利要求3或4所述的农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征是，加入的乙酰胆碱酯酶与载体的比例为1～5U/片，加入的双功能团试剂戊二醛与载体的比例为0.2～0.5μl/片，加入的牛血清白蛋白与载体的比例为1～3μl/片。
6.根据权利要求3或4所述的农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征是，物理吸附载体采用尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜或滤纸，优先使用滤纸，使用尼龙膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜为物理吸附载体还需增加载体预处理、洗涤保存两个步骤。
7.根据权利要求3所述的农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征是，所述的步骤(2)中，将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液浓度为400～800mg/l，物理吸附载体放入该溶液中浸泡时间为15分钟。
8.根据权利要求3所述的农药环境污染诊断速测卡的制造方法，其特征是，所述的步骤(3)中，放入包装盒内的成型的诊断速测卡为15张，提取液为1瓶。
全文摘要
一种农药环境污染诊断速测卡及其制造方法，属于诊断检测用品领域。速测卡的诊断区用透明塑料、反应区用纸制成，诊断区在上，反应区在下，诊断区上载有多片生色片，反应区上对应地载有同样数量的基质片。方法如下采用的酶源为昆虫匀浆液或动物血清中的乙酰胆碱酯酶，酶的固定化采用交联法，用双功能团试剂、载体蛋白及其磷酸缓冲液把酶固定到载体上，即为生色片；将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，然后，把物理吸附载体放入该溶液中浸泡，置于小型通风橱中阴干，即为基质片；将生色片和基质片分别对应地固定在诊断区和反应区上，再将成型的诊断速测卡和提取液放入包装盒内即可。
文档编号G01N21/77GK1540320SQ20031010826
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月30日 优先权日2003年10月30日
发明者陆贻通, 沈国清, 周培, 洪静波 申请人:上海交通大学