专利名称：一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于免疫化学检测领域，具体来说，涉及一种快速定量检测降钙素原 免疫层析试纸条。
背景技术：
降钙素原(procalcitonir^PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，是由116个氨 基酸组成，分子质量为13KD的糖蛋白。PCT由神经内细胞分泌(包括甲状腺、肺和胰腺组 织细胞)表达，经酶切分解为降钙素(CT)、羧基端肽和氨基端肽。PCT在人体内的半衰期为 25-30h,稳定性良好，在正常人血清中含量极低。在导致全身炎性反应综合征(S^S)的许多情况下，诸如细菌性感染、胰腺炎、烧 伤、多发伤，血中CT前肽物质的所有剪接产物异常升高，其中PCT是最主要的产物，而CT则 无明显变化。血PCT水平与感染及损伤的严重程度呈正相关，且已成为用于脓毒症、严重脓 毒症、脓毒性休克的诊断和疗效监测的有效指标。目前用于检测PCT的方法有酶免和放免法酶免法采用双抗体夹心，用人工合成的PCT单克隆抗体检测。方法 较特异，无交叉反应。放免法利用由人工合成的57个氨基酸部分制成的R2B7特异性多克 隆抗体，既能检测游离型PCT，又能检测结合型PCT，此酶免法提高了灵敏度，但耗时较长， 且标记的放射性元素存在污染，因此限制了放免法的临床应用。全自动快速定量法此方法是羊的多克隆抗体与一个单克隆抗体与PCT分子的 Calcitonin和Katacalcin片段结合。计算机控制，操作全自动化，灵敏度高，变异系数�。� 重复性好。测试时间为20 min，测试范围0.06-50ng/ml。金标法此法用一个结合有胶体金的抗降钙素的单克隆小鼠抗体和抗降钙素的多 克隆绵羊抗体进行检测。此法不依赖仪器，操作方便快速，适用于床旁检测。免疫荧光法是一种定量的免疫学检测方法，采用两个抗原特异性抗体与PCT两 个不同抗原结合位点结合，一种抗体经荧光标记固定在管壁上，两种抗体分别与血浆或血 清中PCT分子结合。荧光信号强度与PCT的浓度成正比，2h内完成。纳米免疫磁珠是含有铁元素的超顺磁纳米颗粒，外面包覆着聚乙烯类高分子物 质，并可带有羧基或氨基，用于和蛋白质分子交联。免疫磁珠在细胞和大分子分离、纯化及 诊断上都已得到应用。但在免疫层析诊断试剂上还鲜有应用。美国Quantum Design公司 最新推出了测定层析试纸上微量磁性物质的检测仪(MICT)，能定量检测到微量(pg级)的 磁性物质，为纳米免疫磁珠检测试剂的研制提供了可能。纳米免疫磁珠检测试剂基本原理如下利用免疫磁珠标记一种抗原或抗体，在试 剂的NC膜上包被相应的抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，标记 磁珠颗�：脱分信涮逑嘟岷闲纬筛春衔铮缓笤贜C膜上层析，再被包被抗原或抗体捕 获，聚集在检测线上，通过MICT测定检测线上捕获磁珠的含量进行检测，而不是依靠肉眼 去判定，使结果判定更为精确、灵敏、客观和便于记录保存。利用纳米免疫磁珠研制降钙素原检测快速诊断试剂尚无报道。
实用新型内容本实用新型所要解决的技术问题是提供一种快速定量检测降钙素原免疫层析试 纸条，使用本实用新型时，仅需一步操作，即可在15分钟内实现定量检测降钙素原的含量， 省去了血液样本要经过离心步骤才能得到血清样本的步骤，大大提高了筛查的速度。本实用新型解决上述问题所采用的技术方案是一种快速定量检测降钙素原免疫 层析试纸条，包括底板、样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、示 踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，水平方向顺序相接并固定在底板上；并且所述示踪 粒子结合垫设有超顺磁颗粒或荧光颗粒标记的降钙素原单克隆抗体吸附层；所述硝酸纤维 素膜上设置有降钙素原单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。本实用新型的一个优选方式是如上所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析 试纸条，还包括盒体，底板置于盒体内，所述盒体盒面上对应于硝酸纤维素膜的位置设有观 察窗，对应于样品垫的位置设有加样孔。这里的底板还包括固定于底板的样品垫、示踪粒子 结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫等部件共同位于盒体内。所述观察窗为方形孔或透明片。所述超顺磁颗粒为氨基化超顺磁颗粒、羧基化超顺磁纳米颗�：汪腔炒拍擅� 颗粒中的一种。所述荧光颗粒为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶和 别藻青蛋白中的一种。所述吸水垫为吸水纸或滤油纸。本实用新型工作原理是将降钙素原单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体以条带 状固定于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，将标记有超顺磁颗粒或荧光颗粒的降钙素 原单克隆抗体复合物吸附在结合垫上，当待测样品加到样品垫上后，通过毛细作用向前移 动，与示踪粒子结合垫上的超顺磁颗粒或荧光颗粒标记的降钙素原单克隆抗体复合物相溶 并相互反应，继续向前移动经过硝酸纤维素膜上含有相对应的检测线区域时，血液样品中 的降钙素原会在检测线的位置形成反应线，通过免疫磁珠分析仪读取检测线的反应信号， 通过测定校准品绘制标准曲线和分析软件得出样本中的降钙素原百分含量。对于上述一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条的制备方法，本实用新型解 决所述技术问题采用的技术方案包括如下步骤⑴样品垫的制备将浓度为0. 5mg/ml-lmg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓 冲溶液处理包被载体，低温冻干，裁切成长条备用。⑵示踪粒子结合垫的制备将超顺磁颗粒或荧光颗粒与待标记抗体按照其特有的 化学交联标记手法进行标记，免疫荧光复合物通过凝胶层析柱纯化，免疫磁珠复合物通过 磁铁吸引进行纯化，将示踪粒子标记复合物按照一定的浓度，采用浸泡法均勻的铺到玻璃 纤维膜上或喷金工艺喷点到聚酯膜上，最后通过真空干燥、冻干或加热干燥的方式去除水 份即得到示踪粒子结合垫。所述超顺磁颗粒为氨基化超顺磁颗粒、羧基化超顺磁纳米颗�：汪腔炒拍擅� 颗粒中的一种。[0023]所述荧光颗粒为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶和 别藻青蛋白中的一种。⑶硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备用包被机将吸入到检测线注射泵中的适 当浓度的降钙素原单克隆抗体溶液在硝酸纤维膜上条状固定，形成检测线；用包被机将吸 入到质控线注射泵中适当浓度的羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液在硝酸纤维膜上条状固定，形 成检测线，于37°C干燥过夜后备用。加热干燥或真空干燥，密封保存备。所述硝酸纤维素膜采用尼龙膜、羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。⑷吸水垫的制备将吸水纸按照一定的规格切割，密封保存备用。⑶半成品大板的制备将吸水垫，设置有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，示踪粒 子结合垫，以及样品垫按照固定的位置粘贴到底板上。所述底板为不吸水的硬质塑料或硬纸片。(6)成品试纸条的制备用切条机将半成品大板切割成半成品试纸条，将半成品试 纸条装入注塑卡中，与干燥剂一起装入铝箔袋中热封，最后按照包装规格将铝箔袋装入到 外包装盒中，得到成品试纸条。综上所述，本实用新型与现有技术相比，具有如下优点⑴本实用新型制作方便，体积小、便于携带。⑵本实用新型盒体上设有供样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据分析 仪判定结果，准确可靠。⑶利用本实用新型进行降钙素原的检测时间仅为15分钟，检测线性范围为 0.01ng/ml — 500ng/mlo⑷本实用新型将超顺磁颗粒或荧光颗粒作为示踪粒子，没有有害物质及放射性物 质的参与，安全可靠。( 本实用新型可通过磁信号分析仪的软件系统计算出降钙素原的百分含量，方便 医生进行结果的分析和诊断。(6)本实用新型可批量生产，适用于临床快速诊断和现场的快速检测；易于保存，有 利于基层单位推广。
图1是实施例1的结构示意图。图2是实施例2的结构示意图。图中标记相对应的部件名称1-底板；2-硝酸纤维素膜；3-示踪粒子结合垫； 4-样品垫；5-吸水垫；6-盒体，7-加样孔；8-观察窗；T-检测线；C-质控线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图，对本实用新型作进一步的详细说明，但本实用新型的实 施方式不限于此。实施例1如图1所示，一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，包括底板1，样品垫4、 示踪粒子结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水垫5 ；所述样品垫4、示踪粒子结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水垫5，水平方向顺序相接并固定在底板1上。所述示踪粒子结合垫3设有超顺 磁颗粒或荧光颗粒标记的降钙素原单克隆抗体吸附层；所述硝酸纤维素膜上设置有降钙素 原单克隆抗体构成的检测线T和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线C。本实施例中，所述底板材料为不吸水的硬质塑料或硬纸片。所述超顺磁颗粒为氨 基化超顺磁颗粒、羧基化超顺磁纳米颗粒和羟基化顺磁纳米颗粒中的一种。所述荧光颗粒 为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶和别藻青蛋白中的一种。 所述硝酸纤维素膜，也可以用尼龙膜、羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。所述吸水垫5为吸 水纸或滤油纸。实施例2如图2所示，一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，还包括盒体6，底板1置 于盒体6内，所述盒体6盒面上对应于硝酸纤维素膜2的位置设有观察窗8，对应于样品垫 4的位置设有加样孔7。这里的底板1还包括固定于底板的样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸 纤维素膜和吸水垫等部件共同位于盒体内。本实施例中，所述观察窗8为方形孔或透明片。实施例3快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条的制备方法如下⑴样品垫的制备①配制浓度IOmM，pH = 7. 2-7. 4的PBS缓冲液。②用①步骤中的缓冲液稀释抗人红细胞抗体或植物凝集素至浓度为0.5mg/ ml-lmg/mlo③将步骤②中的溶液按照一定的包被体积，均勻铺到玻璃纤维膜包被载体上。包 被方式可以采取用移液器将包被溶液均勻的铺到玻璃纤维膜中，也可以采取将玻璃纤维膜 置于步骤②中的溶液中浸泡均勻。④处理好的玻璃纤维膜包被材料采用冷冻干燥、真空干燥或加热干燥的方式处理 去除水份。⑤将步骤④干燥好的玻璃纤维膜裁切成适当大小的长条后密封干燥保存。⑵制备免疫磁珠复合物结合垫①取氨基化的超顺磁纳米颗粒5mg，用0. OlM的PBS (pH = 7. 2-7. 4)的缓冲液洗 涤3次，加入到Iml含的戊二醛溶液中，在室温条件下震荡反应1小时。②反应结束后，用磁铁分离磁珠，再用缓冲液充分洗涤除去多余的戊二醛。③加入0. 25mg的待标记抗体，于室温下震荡反应3小时，偶联结束后按照1/10的 比例加入含有2% BSA的封闭液封闭2小时。④用磁铁分离器分离免疫磁珠复合物，用洗涤液清洗2 — 3次，最后用复溶液10% 重悬免疫磁珠复合物。⑤用IOmM Tris 一 HCl缓冲液(1% 854，2%海藻糖)按照一定的比例稀释磁珠抗 体复合物，采用浸泡法均勻的铺到玻璃纤维膜上或喷金工艺喷点到聚酯膜上。⑥将包被有免疫磁珠复合物的结合垫采用真空干燥、冻干或加热干燥的方式去除 水份，按照一定的规格切割，密封保存。本实施例中的氨基化超顺磁纳米颗粒也可以用羧基化超顺磁纳米颗粒、羟基化顺磁纳米颗粒、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶或别藻青蛋白代替。⑶硝酸纤维素膜的包被①配制lmg/ml降钙素原单克隆抗体，包被稀释液为pH = 7. 2-7. 4的IOmM PBS (2%蔗糖)。②配制1 mg/ml羊抗鼠I g G多克隆抗体，包被稀释液为pH = 7. 2-7. 4的IOmM PBS (2%蔗糖)。③将lmg/ml降钙素原单克隆抗体泵入注射泵1中，1 mg/ml羊抗鼠I g G多克隆 抗体泵入注射泵3中，包被体积为 μ /cm，将上述两种溶液包被固定到到硝酸纤维素膜适 当的位置，分别为检测线T和质控线C。④加热干燥或真空干燥，密封保存备用。所述硝酸纤维素膜可用尼龙膜或羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。⑷制备吸水垫将300mmX 210mm的特种吸水纸切割成300mmX 21mm，密封保存备用。( 制备半成品大板①撕开底板上中间的不干胶，将包被好的硝酸纤维素膜固定在底板上。②撕开底板上靠近质控线一边的不干胶，将吸水垫粘贴在底板上，吸水垫压硝酸 纤维素膜1mm。③撕开底板上靠近检测线一边的不干胶，将结合垫粘贴在底板上，结合垫压硝酸 纤维素膜1mm。最后将样品垫粘贴在底板上，样品垫末端与底板末端对齐。(6)制备成品试纸条①采用切条机将半成品大板切成半成品试纸条。②将上述半成品试纸条放入注塑卡中，置于压卡机上。③将一人份上述半成品试纸条和一人份干燥剂装入铝塑袋中。④再将铝塑袋开口端热封即可。⑤将封好的铝塑袋装入外包装盒中，得到成品试纸条。如上所述，便可较好的实现本实用新型。
权利要求1.一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，包括底板(1)，其特征在于，还包括样 品垫(4)、示踪粒子结合垫(3)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(5)；所述样品垫(4)、示踪粒子 结合垫(3)、硝酸纤维素膜(2)和吸水垫(5)，水平方向顺序相接并固定在底板(1)上；并且 所述示踪粒子结合垫(3)设有超顺磁颗粒或荧光颗粒标记的降钙素原单克隆抗体吸附层； 所述硝酸纤维素膜上设置有降钙素原单克隆抗体构成的检测线(T)和羊抗鼠IgG多克隆抗 体构成的质控线(C)。
2.根据权利要求1所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，其特征在于， 还包括盒体(6)，底板(1)置于盒体(6)内，所述盒体(6)盒面上对应于硝酸纤维素膜(2)的 位置设有观察窗(8)，对应于样品垫(4)的位置设有加样孔(7)。
3.根据权利要求2所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，其特征在于， 所述观察窗(8)为方形孔或透明片。
4.根据权利要求1所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，其特征在于， 所述超顺磁颗粒为氨基化超顺磁颗粒、羧基化超顺磁纳米颗粒和羟基化顺磁纳米颗粒中的 一种。
5.根据权利要求1所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，其特征在于， 所述荧光颗粒为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、多甲藻黄素叶绿素蛋白、碘化丙啶和别藻青蛋 白中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，其特征在于， 所述吸水垫(5)为吸水纸或滤油纸。
专利摘要本实用新型公开了一种快速定量检测降钙素原免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫、示踪粒子结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，水平方向顺序相接并固定在底板上；并且所述示踪粒子结合垫设有超顺磁颗粒或荧光颗粒标记的降钙素原单克隆抗体吸附层；所述硝酸纤维素膜上设置有降钙素原单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。本实用新型不仅填补了目前市场上没有超顺磁或荧光免疫层析定量检测糖化血红蛋白的空白，同时也提高了检测灵敏度和准确度，并且将定量检测时间大大缩短。
文档编号G01N33/68GK201886025SQ20102065155
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者刘东泽, 刘廷勇, 包德全, 唐涪嘉, 王保宁 申请人:四川迈克生物科技股份有限公司
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