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专利名称：一种测定奶粉中肽含量的方法
技术领域：
本发明涉及肽检测技术，尤其涉及奶粉中肽含量的测定方法。
技术背景肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是介于大分子蛋白质和氨基酸之 间的一种具有生物活性、容易吸收的营养物质。肽以其具有生物活性、利于人体消化吸收 等优点广泛应用在乳制品、保健食品等行业。因此，建立准确快速的测定奶粉中肽含量的 方法符合行业的发展需求。蛋白质的分析方法包括光谱法、色谱法和生物化学法等。目前的科学研究中，肽的测 定方法是利用高效液相色谱仪来分离检测。蛋白质中常见的氨基酸有20种，每一种氨基 酸在肽中的位置又可以不同，因此肽的种类巨大，准确测定其中每一种肽的含量非常复杂。 因此高效液相色谱法检测肽含量的方法既不快速，也不实用，不适合应用于实际生产中的 质量监控。光谱法具有快速性和方便性的特点。光谱法测定蛋白质含量的方法很多，如 ①基于碱性条件下含有肽键的化合物与Cl^+形成紫红色络合物的双縮脲法；②基于碱性条件下Folin酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸或色氨酸还原成蓝色化合物的Folin酚试剂法(即 Lowry法)；③基于酪氨酸或色氨酸在280nm处有吸收高峰的紫外吸收法；④基于肽键在 215nm和225nm有特征吸收的紫外吸收法；⑤基于蛋白质与染料结合后发生颜色变化的考 马斯亮蓝染色法等。其中方法①和④是建立在肽键的基础之上的，并以双縮脲法比较常用， 而且方法④的干扰因素较多。奶粉中除了肽以外，还含有大分子的蛋白质，二者都含有肽键(-CO-NH-)，都会与双 縮脲试剂发生反应而形成紫红色络合物，因此，在采用双縮脲法测定奶粉中肽含量的过程 中，必须排除大分子蛋白质对测定结果的影响。发明内容本发明的目的在于建立一个操作简便、实用性强的奶粉中肽含量的快速检测方法。上 述目的是通过如下技术方案实现的一种测定奶粉中肽含量的方法，包括以下步骤
1) 将奶粉溶解于水，在酸性条件下采用加热沉淀法和重金属盐溶液沉淀法沉淀其中 的大分子蛋白质，离心去除沉淀；
2) 取上清液进行双縮脲反应，然后在540nm检测溶液的吸光度值；
3) 配制一系列浓度的肽标准溶液，同样进行双縮脲反应，然后在540nrn检测溶液的 吸光度值，制作肽浓度-吸光度值的标准曲线；
4) 根据吸光度值与肽浓度成正比的规律，通过标准曲线获得步骤2)得到的吸光度值 对应的肽浓度，从而计算出奶粉中的肽含量。
上述步骤1)充分考虑了奶粉中大分子蛋白质的特点，乳蛋白中的蛋白质有两类，一 类是酪蛋白，另一类是乳清蛋白，前者在酸性条件下沉淀，后者在加热和有重金属盐存在 的条件下沉淀，因此，本发明沉淀奶粉中大分子蛋白质的方法是酸性条件下加热并加重金 属盐溶液的沉淀法。具体的做法一般是，将奶粉溶解于水，用酸调节pH值至4.0-4.8后先 进行加热沉淀，然后冷却至室温，离心去除沉淀，上清液进一步用重金属盐溶液进行沉淀， 再次离心去除沉淀。上述加热的温度可为80-120°C,加热时间10-30min。重金属盐溶液沉 淀时所用重金属盐的浓度一般在0.1-100 g/L的范围内。沉淀物的去除采用离心的方法，即 在大于或等于2b00r/min的转速下离心5-20min,然后取上清液进行步骤2)的反应。
在步骤l)中，用于调节pH的酸可选自盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、三氯乙酸和磺基水 杨酸中的一种或多种。所用的重金属盐可选自乙酸铅、硫酸铅、氯化铅、乙酸铜、硫酸铜、 氯化铜、乙酸汞、硫酸汞和氯化汞中的一种或多种。
上述步骤2)进行双缩脲反应采用的双縮脲试剂的配制方法一般是称取硫酸铜 (CuS04*5H20) 1.5g，酒石酸钾钠5g，用500mL水溶解，再加10%的氢氧化钠300mL， 溶解后用水定容至1000mL。
上述步骤3)制作肽浓度-吸光度值标准曲线时，通常是先将含有2-10个氨基酸残基的 任意一种肽用酸性水溶液配制成肽浓度为1-5 g/L的溶液，然后用酸性水溶液进行梯度稀 释，获得一系列浓度的肽标准溶液，分别加入双縮脲试剂进行反应，并于540nm下测定吸
光度值OD，nm。以肽浓度(g/L)为横坐标X, OD540咖为纵坐标Y，制作标准曲线。其中
所述酸性水溶液所含酸的种类及其pH值通常要求与步骤l)相同，pH值一般为4.0-4.8。 上述步骤2)和3)检测吸光度值时使用的空白对照应相同。
在本发明的一些具体实施例中，上述步骤l)将质量为m (g)的奶粉用水溶解，用酸 调节pH值为4.0-4.8，加热至80-120。C沉淀10-30min，离心后将所有去除沉淀后的上清液 用重金属盐溶液沉淀，静置后离心取上清液，用pH值为4.0-4.8的酸性水溶液将上清液定
容至V(mL)，摇匀后取样加入双縮脲试剂进行步骤2)，在步骤2)和步骤3)进行双縮脲 反应的实验条件完全相同的情况下，步骤4)计算奶粉中的肽含量(mg/g) ="^，其 中C为从标准曲线査到的步骤2)测得的吸光度值对应的肽浓度(g/L)。
本发明所测定的是奶粉中肽的总含量，而无需测定肽混合物中的单一肽。利用含2-10 个氨基酸残基的肽中的任意一种肽作为标准物质，将奶粉溶解后在酸性条件下加热和重金 属盐溶液沉淀奶粉样品中的大分子蛋白后，加入双縮脲试剂完成双縮脲反应，检测吸光度 值，通过标准物质的标准曲线即可计算得到样品中的肽含量。该方法准确、操作简便、实 用性强，能快速检测奶粉中肽的含量，可用于奶粉实际生产中的质量监控。


图1是本发明实施例一中测定的肽浓度-吸光度值标准曲线。 图2是本发明实施例二中测定的肽浓度-吸光度值标准曲线。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明的范围。 实施例一
1、 双縮脲试剂的配制
称取硫酸铜(CuSCV5H20) L5g，酒石酸钾钠5g，用500mL水溶解，再加10%的氢 氧化钠300mL，溶解后用水定容至1000mL。
2、 标准曲线制作
用pH4.5的盐酸水溶液为溶剂配制3 g/L的四肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)溶液，取10支比 色管，依次加入O.O、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6和1.8 mL上述溶液，再分别 用pH4.5的盐酸水溶液补足至6.0mL，混合均匀后，分别加入双縮脲试剂4.0mL混合均匀， 稳定显色后于540nm下测定OD值。以Gly-Gly-Tyr-Arg的质量浓度(g/L)为横坐标X,
ODs咖m值为纵坐标Y,制作标准曲线，见图l。
3、 样品处理
3-1、将质量为m (g)的奶粉样品用水溶解，用盐酸调节奶粉溶液pH值至4.5，制成 样品溶液；
3-2、水浴锅中IOO"C下加热20min，然后冷至室温，在4500 r/min的转速下离心15min，
将全部上清液用20g/L的乙酸铅溶液沉淀，静置10min,再在4500 r/min的转速下离心15min 后，将全部上清液用pH4.5的盐酸水溶液定容至r (mL)，摇匀；3-3、取6.0 mL上述溶液置试管中，加入双缩脲试剂4.0mL，混合均匀，稳定显色后 于540nm下测定OD值(以6.0 mL的pH4.5的盐酸水溶液加4.0mL双縮脲试剂反应后的 溶液作为空白对照)； 4、浓度计算从标准曲线査到步骤3-3测得的OD540nm值对应肽浓度为C(g/L)，贝U:奶粉中的肽含量(mg/g) =^。例如，当m二5g， F二50mL时，肽含量(mg/g) =，^ 。实施例二1、 双縮脲试剂的配制称取硫酸铜(CuS04*5H20) 1.5g，酒石酸钾钠5g，用500mL水溶解，再加10%的氢 氧化钠300mL，溶解后用水定容至1000mL。2、 标准曲线制作用pH4.6的三氯乙酸水溶液为溶剂配制1 g/L的三肽(Glu-Val-Phe)溶液，取10支比 色管，依次加入O.O、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6和1.8 mL上述溶液，再分别 用pH4.6的三氯乙酸水溶液补足至6.0mL，混合均匀后，分别加入双縮脲试剂4.0 mL混合 均匀，稳定显色后于540nm下测定OD值。以Glu-Val-Phe的质量浓度(g/L)为横坐标X，ODs40nm值为纵坐标Y，制作标准曲线，见图2。3、 样品处理3-1、将质量为2.5000g的奶粉样品用水溶解，用三氯乙酸调节奶粉溶液pH值至4.6， 制成样品溶液；3-2、上述溶液在水浴锅中10(TC下加热30min，然后冷至室温，4000r/min离心15min， 将全部上清液用15g/L的硫酸汞溶液沉淀，静置10min，再在4000 r/min的转速下离心15min 后，将全部上清液用pH4.6的三氯乙酸水溶液定容至50mL，摇匀；3-3、取6.0mL上述溶液置试管中，加入双縮脲试剂4.0mL混合均匀，稳定显色后于 540nm下测定OD值(以6.0 mL的pH4.6的三氯乙酸水溶液加4.0mL双縮脲试剂反应后的 溶液作为空白对照)。4、 浓度计算
肽含量(mg/g) =^f"，其中C为从标准曲线中査到的步骤3-3测得的OD54o^值对 应的肽浓度(g/L)。
权利要求
1. 一种测定奶粉中肽含量的方法，包括以下步骤1)将奶粉溶解于水，在酸性条件下采用加热沉淀法和重金属盐溶液沉淀法沉淀其中的大分子蛋白质，离心去除沉淀；2)取上清液进行双缩脲反应，然后在540nm检测溶液的吸光度值；3)配制一系列肽标准浓度溶液，同样进行双缩脲反应，然后在540nm检测溶液的吸光度值，制作肽浓度-吸光度值的标准曲线；4)根据吸光度值与肽浓度成正比的规律，通过标准曲线获得步骤2)得到的吸光度值对应的肽浓度，从而计算出奶粉中的肽含量。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤l)将奶粉溶解于水，用酸调节pH 值至4.0-4.8后先进行加热沉淀，然后冷却至室温，离心去除沉淀，上清液进一步用重 金属盐溶液进行沉淀，再次离心去除沉淀。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤l)中所述酸选自盐酸、硝酸、硫酸、磷 酸、三氯乙酸和磺基水杨酸中的一种或多种。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤l)加热沉淀的温度为80-120°C,加 热时间为10-30min。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤l)中所述重金属盐选自乙酸铅、硫 酸铅、氯化铅、乙酸铜、硫酸铜、氯化铜、乙酸汞、硫酸汞或氯化汞中的一种或多种。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤l)中重金属盐溶液沉淀所用重金属 盐的浓度为0.1-100g/L。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤l)离心的转速大于或等于2000 r/min，时间5-20min。
8. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤3)以含有2-10个氨基酸残基 的任意一种肽配制肽标准浓度溶液。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤3)以酸性水溶液为溶剂配制肽浓度 为1-5 g/L的溶液，其中所述酸性水溶液所含酸的种类及其pH值与步骤1)相同，然后 用同样的溶剂进行梯度稀释，获得一系列浓度的肽标准溶液，分别进行双縮脲反应。
10. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤l)将质量为m的奶粉溶解于水后 用酸调节溶液pH值为4.0-4.8，加热至80-120。C沉淀10-30min，离心后将所有上清液 用重金属盐溶液沉淀，静置后离心，去除沉淀后的所有上清液再用pH值为4.0-4.8的 酸性水溶液定容至体积V，摇匀后取样进行步骤2)，在步骤2)和步骤3)进行双縮 脲反应的实验条件完全相同的情况下，步骤4)计算奶粉中的肽含量=，，其中C 为从标准曲线査到的步骤2)测得的吸光度值对应的肽浓度。
全文摘要
本发明公开了一种测定奶粉中肽含量的方法。该方法利用蛋白质和肽分子中含有的肽键(-CO-NH-)具有双缩脲反应，在碱性溶液中与Cu²⁺形成紫红色络合物的特性，以某种肽作为标准物质，将奶粉用水溶解，在酸性条件下加热并在重金属盐存在的条件下沉淀去除奶粉样品中的大分子蛋白，然后加入双缩脲试剂反应，检测吸光度值，通过利用标准物质制成的标准曲线计算得到样品中的肽含量。本发明操作简便、准确、实用性强，能快速检测奶粉中肽的含量，可用于实际生产中的质量监控。
文档编号G01N21/31GK101398375SQ20081022603
公开日2009年4月1日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者任国谱, 灿 彭, 彭美纯, 肖莲荣, 伟 鲁 申请人:湖南亚华乳业有限公司