专利名称：一种i型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)新发感染酶免检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫检测试剂盒，它的组成、制备及其应用，特别涉及一种I型人类免疫缺陷病毒(Hiv-I)新发感染酶免检测试剂盒(限制性抗原亲和力法)及其制备方法，该试剂盒主要用于在群体水平上区分HIV-I的近期感染和长期感染。
背景技术：
流行病学方法中的前瞻性队列研究，一直被认为是检测HIV新发感染的“金标准”，但由于需要极大的人力、时间及经费投入，队列研究无法广泛应用。另外，队列研究存在失访，因此半开放性或开放队列由于监测人群存在较大变化，一旦无法控制好队列质量，整个队列将出现偏移甚至失去代表性。更为重要的是，在队列观察过程中，随访人群往往容易受到不同程度的行为干扰，从而低估目标人群的HIV新发感染率，并且这一影响往往会随着队列研究的进行而不断加深累积，从而导致HIV新发感染率出现逐渐下降的趋势，感染人们对于疫情的准确判断，措施采取预防控制措施的最佳时机。正是基于队列研究的上述缺陷，以横断面调查样本为基�。ü笛槭壹觳夤浪鉎IV新发感染率的方法，其优势得以凸显。其基本原则是人体在感染HIV后，会出现与感染事件有关的标志物，用过检测这些标志物存在与否或质量/数量的变化，以及所使用的新近感染检测方法的“窗口期”，即可判断是HIV-I感染时间的长短。新进感染监测方法的窗口期不同于过去所说的HIV检测的窗口期，其是指从患者感染HIV开始，将感染者判定为新近感染的一段时间(通常取平均值);而HIV检测窗口期则是指患者感染HIV早期，所有检测方法未能将其判定为阳性的一段时间(盲区)。除HIV核酸检测法外，所有这些方法均可统称为 STARHS (serological testing algorithm for recent HIV seroconversion, HIV新近感染血清学检测法)，最早由Janssen等在1998年提出。由于在横断面研究中，人群没有受到调查干扰，只要合理的定义好目标人群，所估算的HIV新发感染率能很好的代表该人群的真实流行情况。该方法的另一巨大优势是，制药人们保持好历史样本，就能获得HIV新发感染率的历史数据。由于STARHS方法是基于机体感染HIV后出现的各种指标变化而判定感染时间长短的，但人体由于各种因素，特别是抗病毒治疗、疾病进程、个体先天/后天免疫状况及感染的病毒株亚型等影响，会导致上述指标的变化受到干扰或出现反复，从而不能与感染时间保持绝对的线性关系，因此目前所有的STARHS方法均不能用于个体诊断，即不能把结果返给个体，而仅限于公共卫生角度的调查和科学研究，主要是HIV新发感染率的检测、新发感染人群的行为特征及危险因素分析等。近年来出现的HIV新近感染检测方法均是针对HIV-I型，主要有以下几种I、BED-CEIA:BED-CEIA 全称是 HIV-1BED 捕获 EIA 法，简称 BED 法2、条带免疫印迹实验 3、IgG3 抗体4、凝集试验
5、基于唾液样本的新近感染检测6、亲和力试验目前，只有美国Sedia公司可以生产同类产品，该公司生产的HIV-I新发感染检测试剂盒(BED法)已广泛应用于HIV-I新发感染检测领域，但是该方法在使用过程中存在错判率较高的问题。根据相关研究，I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)新发感染酶免检测试剂盒(限制性抗原亲和力法)可以较好的解决上述问题。
发明内容
基于限制性抗原亲和力原理的基础上，提供一种低错判率、质量稳定，满足HIV-I新发感染检测的试剂盒的制备方法。
人体感染HIV-I后，血清中抗HIV-I特异性抗体的亲和力会随着感染时间的延长而增加。本发明采用了单孔限制性抗原IgG捕获酶联免疫法，测定特异性抗体的亲和力。具体原理如下所示I.首先使用可以识别多种亚型的重组HIV-I特异性抗原(gp41)包被酶联板，加入血清样品后置于37° C孵育60min，此时，所有的HIV-I特异性抗体(包括低亲和力和高亲和力的抗体)都会被包被在酶联板上的gp41蛋白所捕获。2.加入酸性洗脱液37° C反应15min，低亲和力的抗体(IgG)就会从酶联板上脱落。3.加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,37° C反应30min后，形成gp41—HIV-I特异性IgG (高亲和力)-HRP标记的抗人IgG复合物。4.加入TMB显色液25° C反应15min。近期感染和长期感染的样品呈现不同的显色强度。5.测量每孔的OD值，然后使用试剂盒中的校准品计算样品的ODn，根据ODn的值来判断样品是近期感染或长期感染。为此，本发明提供一种I型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)新发感染酶免检测试剂盒，本发明的试剂盒，包括以下组分HIV_lgp41 蛋白；空白酶联板；酸性洗脱液；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG ；TMB 显色液；终止液。其中，HIV_lgp41蛋白为gp41嵌合蛋白，可以从市场上购买得到。如购自深圳菲鹏。空白酶联板为NUNC空白酶联板，可以从市场上购买得到。如购自Thermo公司。酸性洗脱液为0. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH=3. O)。酶结合物为含有羊抗人IgG的酶结合物稀释液，其中所述酶结合物稀释液为0. 05M的PBS缓冲液(pH=7. 2)，其中含有1%的牛血清白蛋白，1%蔗糖，0. 1%的吐温-20，0. 1%的 Triton-100 以及 0. 1% 的 Proclin-300
TMB显色液为四甲基联苯胺溶液，可以从市场上购买得到，如购自KPL公司。终止液为IN的硫酸溶液。本发明的试剂盒，是将上述组分进行配制，配制成适合应用的分开包装的单元，本发明的包含的单元如下
权利要求
1.一种I型人类免疫缺陷病毒(HIV-ι)新发感染酶免检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分HIV-lgp41蛋白；空白酶联板；酸性洗脱液；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG ；TMB显色液；终止液。
2.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，其中，HIV-lgp41蛋白为gp41重组蛋白；空白酶联板为NUNC空白酶联板；酸性洗脱液为0.0腿柠檬酸盐缓冲液(？!1=3.0)，酶结合物为含有羊抗人IgG的酶结合物稀释液，其中所述酶结合物稀释液为O. 05M的PBS缓冲液(pH=7. 2)，其中含有1%的牛血清白蛋白，1%蔗糖，O. 1%的吐温-20和O. 1%的Triton-100 ；TMB显色液为四甲基联苯胺溶液；终止液为IN的硫酸溶液。
3.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，是将各组分进行配制，配制成适合应用的分开包装的单元，本发明的包含的单元如下
4.根据权利要求3的试剂盒，其特征在于，其中包被酶联板的制备方法如下 1)制备工艺 2)包被使用O.05Μ的pH为6. O的磷酸盐缓冲液将HIV_lgp41蛋白稀释到O. 063 μ g/mL，然后将稀释后的缓冲液加入到96T的微孔板中，每孔加入100 μ L，然后将微孔板置于4° C包被18 22h; 3)洗板使用自动化洗板机洗板2次，抽干； 4)封闭每孔加入200μ L封闭液,然后将微孔板置于4° C封闭18 22h ； 5)干燥使用自动化洗板机将微孔板抽干，干燥过夜，干燥条件为温度18 25。C，湿度〈30% ； 6)装袋将包被好的酶联板放入铝箔袋中，放入一个干燥剂后封装，置于4°C条件下保存；包被过程中使用的各种液体的配方如下 .1.)包被液配方0.05M的PBS缓冲液(pH=6. O)； . 2.)封闭液配方0.05M的PBS缓冲液(pH=6. 0)，其中含有O. 5%的酪蛋白，2%的蔗糖，.1% 的甘氨酸，O. 1% 的 Proclin-300 ； . 3.)洗液配方0.05M的PBS缓冲液(pH=7. 2)，其中含有O. 05%的吐温-20 ;所有液体配制均采用纯水。
5.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，其中，20X洗涤缓冲液的制备方法如下O. IM的PBS缓冲液(pH=7. 2)，其中含有O. 1%的吐温-20 ;样品稀释液的制备方法如下O. 05M的PBS缓冲液(pH=6. 0)，其中含有O. 5%的酪蛋白，2%的蔗糖，1%的甘氨酸和O. 1%的Proclin-300 ;酸性洗脱液为O. OlM柠檬酸盐缓冲液(pH=3. O);酶结合物为含有羊抗人IgG的酶结合物稀释液，其中所述酶结合物稀释液为O. 05M的PBS缓冲液(pH=7. 2)，其中含有.1%的牛血清白蛋白，1%蔗糖，O. 1%的吐温-20和O. 1%的Triton-100 ;强阳性对照为0D值范围在O. 6-2. I之间的HIV-I型阳性血清；弱阳性对照为0D值范围在O. 2-0. 8之间的HIV-I型阳性血清；校准品为0D值范围在O. 3-0. 9之间的HIV-I型阳性血清；阴性对照为OD值范围在O. 00-0. 25之间的HIV-I型阳性血清。
6.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，其中，本发明的试剂盒，各组分的装量可以根据应用情况确定，以使装量恰当为好，如配制成96人份，192人份，480人份等。
7.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，其中，192人份可以按照以下方法分装组分名称组分含量 20 X洗涤缓冲液60Λ 样品f布释液6 OmL酸性洗脱液60Λ酶结合物25mL显色液25mL终止液25mL强阳性对照(HPC)50 μ L弱阳性对照(LPC)50 μ L 校准品(CAL)50 μ L阴性对照(NC)50 μ L
8.根据权利要求I的试剂盒，其特征在于，其中，将各单元贴标识，组装为成套的试剂盒，保存于2_8°C和-20° C的条件下。
9.权利要求I的试剂盒的使用方法，包括以下步骤A.将500μ L样品稀释液加入样品稀释管,然后加入5 μ L (I : 101)对照品,校准品和待检样品，使用移液器反复吹打(4 6次)，充分混匀后备用。阴性对照准备2份，强阳性对照、校准品和弱阳性对照各准备3份； B.按照上述加样表所示，每孔加入稀释好的对照品、校准品和待检样品各100μ L，盖上封板膜，37°C (土 1°C)孵育60min。初筛试验，每份样品都进行单孔检验，加样顺序如表I所示。确认试验,每份样品进行三孔复检,加样顺序如表2所示。
C.弃去各孔内液体，使用96孔洗板机洗板4次，每次加洗液400μ L/孔，每次洗板静置10秒,拍干； D.每孔加入200μ L酸性洗脱液，轻轻振荡后，盖上封板膜，置37°C温育15min E.重复步骤C; F.每孔加入100μ L的酶结合物，轻轻振荡后，盖上封板膜，置37°C温育30min ； G.重复步骤C; H.每孔加入100μ L显色液，置25°C ( + TC)温育15分钟； J.每孔加入100 μ L终止液，选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm，测定各孔OD值。全文摘要
本发明提供一种I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)新发感染酶免检测试剂盒，本发明的试剂盒，包括以下组分A.HIV-1gp41蛋白；B.空白酶联板；C.酸性洗脱液；D.辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)；E.四甲基联苯胺(TMB)显色液；F.终止液。
文档编号G01N33/569GK102680681SQ201210166939
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者叶艺, 张誌, 戈军, 曹健荣 申请人:北京金豪制药股份有限公司
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