专利名称：新型三聚氰胺抗原和抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域；涉及有机合成、免疫化学、生物化学以及物化测试技术等，特别涉及三聚氰胺半抗原、人工抗原、酶标抗原的设计合成和免疫动物、特异性抗体的制备及免疫分析方法的建立，尤其是一种新型三聚氰胺抗原和抗体及应用。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)是一种在常用的化学原料，与甲醛缩合聚合可制得三聚氰胺树脂，可用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防摺、防缩处理剂。三聚氰胺改性树脂可做色泽鲜艳、耐久、硬度好的金属涂料，三聚氰胺还可用于坚固、耐热装饰薄板，防潮纸及灰色皮革鞣皮剂，合成防火层板的粘接剂，防水剂的固定剂或硬化剂等。三聚氰胺被非法添加至乳制品中以提高其含氮量，从而在用凯氏定氮法测量蛋白含量时获得较高的蛋白浓度。人如果长期摄入会导致人体泌尿系统膀胱、肾产生结石，并可诱发膀胱癌。世界各国都制定了三聚氰胺的限量标准，我国参照AOAC制定的标准制定了我国的限量标准:婴儿配方奶粉中婴儿配方食品中限量值为lmg/kg，其他普通食品中的限量值为2.5mg/kg。由于三聚氰胺属于小分子物质，目前的检测方法包括液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法，气相色谱-质谱法等，这些方法具有成本较高、分析速度慢，难以满足大通量的实际需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。三聚氰胺作为一种分子量仅有126的小分子化合物，其免疫分析方法与大分子的免疫分析方法存在较大不同。⑴三聚氰胺本身不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物并产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决定产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。⑵虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。⑶基于抗原抗体免疫反应检测小分子化合物的分析技术，目前多采用酶联免疫分析(ELISA)。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度。小分子化合物依靠 免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型三聚氰胺抗原和抗体及应用，设计合成具有氯甲基结构的三聚氰胺类似物，在此基础上合成三聚氰胺半抗原、人工抗原和酶标抗原，其创新之处在于利用该氯甲基结构与3-巯基丙酸反应接臂制备半抗原，避免了传统的以三聚氰胺为原料直接合成半抗原过程中反应位点无法控制的缺点。本方法合成的人工抗原免疫动物产生了特异性很高的抗体，并以此为基础建立了 ELISA方法，可以快速、准确检测三聚氰胺。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种三聚氰胺半抗原前体，结构式如下:
权利要求
1.一种三聚氰胺半抗原前体，其特征在于:结构式如下:
2.—种三聚氰胺半抗原，其特怔在于:结构式如下:
3.如权利要求2所述的三聚氰胺半抗原在制备三聚氰胺抗原中的应用。
4.一种三聚氰胺人工抗原，其特征在于:结构式如下:
5.一种如权利要求4所述的三聚氰胺人工抗原经动物免疫后获得的三聚氰胺抗体。
6.权利要求5所述的三聚氰胺抗体在检测三聚氰胺方法中或检测三聚氰胺试剂中的应用。
7.—种三聚氰胺的酶标抗原，其特征在于:结构式如下:
8.权利要求7所述的三聚氰胺的酶标抗原在检测三聚氰胺方法或检测三聚氰胺试剂中的应用。
9.一种三聚氰胺的免疫检测方法，其特征在于:方法如下: 包被:将权利要求5所述的抗体溶于50mmol、pH9-10的碳酸盐缓冲液中， 配制成10 μ g/mL的包被液，酶标板每孔加100 μ I包被液4°C孵育12-16小时，将包被好酶标板的每个孔，用磷酸盐缓冲液加0.05%v/v Tween20洗液PBST洗涤三次； 封闭:每孔加入200 μ 1,0.5%脱脂乳粉/PBS封闭液，封闭Ih ； 加样:将待测样品溶于磷酸盐缓冲液PBS中，加样时每孔加入50 μ I标样； 竞争反应:将权利要求7所述的酶标抗原溶于PBS缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入50 μ I酶标抗原溶液，孵育Ih后用PBST洗涤三次； 显色:显色底物使用四甲基联苯胺，将5mg四甲基联苯胺溶于Iml PBS缓冲液中，配制成浓度为0.1%的底物溶液，显色时每孔加入150 μ I的底物溶液和5 μ I双氧水，显色15分钟后每孔加入50 μ 15mol /L的硫酸终止；反应液在酶标仪上读数。
全文摘要
本发明涉及新型三聚氰胺抗原和抗体及应用，采用双胍与氯乙酸乙酯在甲醇钠条件下合成6-氯甲基-1,3,5-三嗪-2,4-二氨基，再与3-巯基丙酸反应得到半抗原3-((4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-基)-甲硫基)丙酸，采用活化酯法偶联蛋白得到人工抗原，经动物免疫、取血、分离抗血清、纯化制得三聚氰胺抗体。本合成方法合理，线路简单，半抗原最大限度的与目标物一致。制备的三聚氰胺抗体灵敏度高，完全满足三聚氰胺快速检测的需要。
文档编号G01N33/543GK103145633SQ20131004886
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者王硕, 刘冰, 史小文 申请人:天津科技大学
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