专利名称：用于筛选具有增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞刚性的能力的化合物的 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于筛选具有增加受疟原虫(Plasmodium)属原生动物寄生虫特别是 热带疟原虫(Plasmodium falciparum)感染的红血球细胞(RBC)刚性的能力的化合物的方法。本发明还涉及用于过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异�：吞乇鹗墙档� 的变形能力的RBC保留。所述方法可以，具体地，分离和/或检测疟原虫感染RBC或与下述 疾病相关的异常RBC:后天或遗传性球形红细胞症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫 血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖 6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球酶)，和与来自患者的血液样本的脾肿大有关的其 它红血球细胞疾�。蛱逋夥治龌颊叩钠⒐δ�。本发明进一步涉及所述方法的应用，用于筛选选择性地与受疟原虫属原生动物寄 生虫感染的红血球细胞相互作用并适合增加它们刚性的化合物。
背景技术：
疟原虫属的原生动物寄生虫引起人和很多动物种类中的疾病(疟疾)。在人类 中，疟疾主要由热带疟原虫、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)禾口间日疱原虫(Plasmodium vivax)引起。热 带疟原虫是最主要的病因并且是所有疟疾病例中约80 %病例的发病原因，并且还是人类疟 疾死亡中约90%的病因。寄生虫疟原虫还感染动物，包括鸟、爬虫和哺乳动物，特别是猴、 猩猩和啮齿动物。由几种疟原虫的猿猴种类，即诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫(Plasmodium inui)、食蟹猴疱原虫(Plasmodium cynomomlgi)、似卵形疱原虫(Plasmodium simiovale)、 巴西疟原虫(Plasmodium brazilianum)、许氏疟原虫(Plasmodium schwetzi)和吼猴疟原 虫(Plasmodium simium)引起的人类感染也已经有记载。热带疟原虫首先感染肝脏，但是然后转移进入血液，在其中扩增并在红血球细胞 (也称作RBC、红血球或红细胞)中持续保持无性复制循环。在侵入红血球细胞后，热带疟 原虫经过连续的表型变化和几轮有丝分裂。在约48小时后，受感染的红血球细胞破裂并释 放游离寄生虫(裂殖体)，其或者侵入另一个红血球细胞，或者快速(在半小时内)通过各 种机制离开血流。疟疾的发病机理与多种寄生虫和宿主因子有关^脾过滤和免疫功能对于实验模 型中疟原虫感染的过程有重要影响2’3。在疟疾流行的国家中，脾切除术容易引起发烧、更频 繁和更高的寄生虫感染量(包括寄生虫的循环成熟形式)，并且可能再次激活潜伏的疟原 虫感染4’5。除了相对较少的已发表数据(在5中进行了综述)，临床医生将疟疾包括在证明 在脾切除非免疫患者中日益引起重视的感染性疾病名单中6。因为动物和人类疟原虫感染 之间的关键特征可能不同，并且因为人类脾脏的深入探索受到伦理和技术的限制7，所以仅对热带疟原虫感染红血球细胞(iRBC)和人脾脏微循环结构之间的精确相互作用进行了间 接或通过验尸而进行探索“1。因此，在人疟疾期间推定的脾脏保护或发病作用下的机制主 要仍然是推测性的。人脾脏可以感受RBC变形能力中的适度变化，所述机制导致衰老或异常RBC的选 择性生理保留/破坏"’48。在几种病理状态中，RBC保留与脾肿大相关。同样的机制下，脾 切除术减轻了患有各种红血球细胞疾病的患者中的贫血，所述疾病包括遗传性球形红细胞 症，和遗传的RBC疾病49。遗传性球形红细胞症由RBC膜(包括其皮质细胞骨架)的结构 组织改变而表征，并且脾脏隔离是RBC(球形红细胞)寿命减少的主要机制。遗传性球形红 细胞症疾病的严重性与膜表面积的降低程度直接相关，并且因此导致变形能力的降低5°。通过其红髓(RP)的特殊微循环结构进行RBC变形能力的脾脏特异性感应。最广 为人知的变形能力-感应结构是红髓窦壁中的内皮间间隙(IES)。这是动态的0. 2-2μπι宽 (如同从人脾脏样本的光学和超结构显微镜图片所估计的)，0. 5-3 μ m长的间隙，位于2个 串状内皮细胞之间，通过所述间隙，离开脾红髓索的RBC必须经过挤压，到达窦腔和静脉循 环"’21’51。IES可能是体内最严紧的RBC变形能力-感应结构。为了穿过静脉窦中狭窄的 IES，RBC经过相当程度的变形如果细胞不能充分变形，会保留在静脉窦壁的上游“。期望 这种RBC-处理功能作用于RBC上寄生的疟原虫上12。RBC是热带疟原虫的主要宿主细胞(无性和有性红细胞阶段)52。裂殖子侵入RBC， 在其中发育48小时，然后产生新一代裂殖子。RBC内部寄生虫的发育导致宿主细胞膜的改 变，表现为新结构、功能和抗原性质，其中有些性质与罕见的严重热带疟原虫感染有关13’14。 根据广泛接受的范例，热带疟原虫的RBC寄生无性形式(iRBC)在侵入后循环16-20小时 (环状阶段)，然后在红细胞循环内的最后观-32小时过程中隔离在脉管系统中(营养共生 和裂殖体阶段)36。因此，环状-iRBC是循环中发现的主要热带疟原虫形式，与细胞粘附的 成熟-iRBC的组织隔离相反。成熟-iRBC的变形能力显著下降，将导致在“经典”血管床中 那些逃逸隔离的脾脏中保留15。此外，获得自疟疾患者血液，然后在活体外加热僵化、标记 并为相同患者重新注射的RBC(热带疟原虫感染RBC)，由脾脏快速清除39。在本上下文中，定量的脾循环框架是对于疟疾发病原因一致理解的基本先决条 件。先前对朝向动物中开放式循环的过滤床的脾血流的比例经实验确定从90% 16至10% "，确保指导对人的体内探索。我们在本文(和在54中)利用两种概念上相关的方法健康志愿者的体内成像，和 用培育的iRBC刺激活体外的人脾脏灌注系统，报道人脾脏生理和疟疾发病原因的互补方 面。我们在本文中首先提供人脾脏内双室血液循环的体内证明，慢室占流量的10%。体外 培养中超过50%的热带疟原虫环状感染RBC (环状)由离体-灌注的人脾脏保留，并沿着窦 壁的近端积累(即，内皮间间隙的上游54)。我们表明，在每次脾脏传代时，环状-iRBC中先 前忽略的子群体中的10%保留在人脾RP的缓慢、开放式循环结构中，最有可能的是通过机 械过程实现。这些结果揭示了环状阶段寄生虫的不均勻性，并为由脾脏进行的RBC过滤提 供新视角，为疟疾患者中寄生虫扩增和RBC损失的控制带来曙光。不同于携带未成熟配子体的RBC-其为固着的-携带成熟配子体的RBC (后文称作 成熟配子体)在外周血液中循环53。因为成熟配子体循环，所以可为嗜血的疟蚊所利用。当 成熟配子体包含于疟蚊的血液大餐中时，会启动寄生虫有性阶段的完全发育，这是由热带疟原虫传播到其他人类所必需的步骤。因此，人外周血液中RBC寄生环或成熟配子体的存在是脾脏中具有这些热带疟原 虫发育阶段的RBC部分同时保留或不同时保留的指示。RBC变形能力(和脾中RBC的保留)依赖(至少)3个因素膜粘弹性、细胞质粘 性，和细胞的几何尺度，其标志是表面积与体积的比例28’5°。可以根据有/没有同渗容摩变 化(激光衍射计，Lorca)时的切应力下RBC群体的伸长指数估计RBC变形能力50。经过过 滤膜的时间也可以在群体水平反映RBC变形能力。因此这些工具的应用限于研究占全部的 比例小于10%的子群体(最常见的是临床或培育样品中的Pf-iRBC)。在先技术中公开的 微量吸管和微流体设备可以测量RBC在有限表面上变形或者流过狭窄如1 μ m(但是通常> 5μπι长)的通道的能力55。因为它们的读数是在单细胞水平，所以这些工具不适用于大型 (> IO3细胞)RBC群体的快速分析。因为通过现有工具不能适当地模拟RBC和Pf-iRBC体 内通过IES时的罕见变形，所以没有经过验证的、能预测脾保留的RBC变形能力的标志-包 括严紧的“内皮间间隙通过刺激”。本发明通过提供用于过滤RBC的方法克服了上述困难，所述方法使过滤单元中具 有异常特别是降低的变形能力的RBC保留。本方法能用于从来自患者的血液样本检测疟原 虫感染RBC或变形能力改变的RBC (例如球形红细胞)的存在，或者用于患者脾生理状况的 体外分析。此外，可以从珠层取得僵化的RBC，在细胞、子细胞和分子水平进一步比较分析，所 述分析用不同子群体进行。还易于自动化，并允许进行僵化RBC的清除和浓缩，在遗传或后 天的RBC疾病中具有广泛的潜在实验和医疗应用。
图1 人脾软细胞组织中血液循环的超声分析。(a)接收Sonovue微 气泡恒定灌注的人志愿者的脾中超声信号强度的增强。(bl)对子囊区域[(a)中的白 线]信号强度在超声诱导下的降低43研究了 >8秒。用双指数曲线(TC)获得了对于 得到的实验信号-时间曲线(EC)的最佳拟合，如同这个典型实例所示(在全部16个 志愿者中，关联系数R2> 0.96)。(b2)信号强度对时间的双指数数学模型N(t)= V1 (C0Oexp (- β…)+V2 (B+ (C0-B) exp (- β )的图示，其中第一和第二项分别对应于慢室和 快室。(c)源自这些观察的人脾软组织细胞中血液循环的示意图。图2 通过离体-灌注的人脾清除iRBC。(a)在用离体-灌注人脾的6个独立实验 之一的120分钟灌注过程中，热带疟原虫FUP裂殖体-iRBC( Δ )和环状_iRBC(·)的寄生 虫感染量(全部6个实验如图7al-6所示)。(b)末端实验脾样本的透射电镜，表示红髓窦 内腔(SL，bl)中有结节的裂殖体-iRBC[S，bl-2，(横杠=1) (b2，箭头)，和索(Co，bl)中 的无结节环状iRBC(R，bl-3)。保留的环状-iRBC的另一个实例如图4所示(dl_2)。图3 在“循环”和“循环-再循环”实验过程中环状-iRBC清除的模拟。发现两个 环状-iRBC子群体。(a)灌注液中环状-iRBC寄生虫感染量的模拟，通过理论实例由图形 阐述没有残留寄生虫感染量的单室(al)、没有残留寄生虫感染量的双室(a2，直线对应于 双指数曲线，虚线对应于单指数曲线)，和有残留寄生虫感染量的单室(平台期，a3)。根据 赤池信息准则(AIC)、参数评价的变异性(VC) (AIC和VC值越小，模型越差)和测量浓度和 预测浓度之间权重差相对于时间的随机分布，评价拟合程度和估计的参数。个体数值如表1 所示。对于双室模型和有残留寄生虫感染量的1-室模型，AIC低于没有残留寄生虫感染量的单室模型。然而，对于双室模型，第二个半衰期参数的变异系数不显著(> 100%)。所 以，有残留寄生虫感染量的单室模型是最好的模型。(b) “循环-再循环”实验。将为脾刺 激制备的部分iRBC和RBC群体(“脾原初”群体)在灌注培养基中保持在37°C，而其它部 分灌注脾脏。(bl)灌注开始四十分钟后，从循环灌注液获得iRBC和RBC( “脾传代”群体， bl)。使用PKH46或PKH-76差异标记两个群体，然后合并并在初始灌注步骤后110-120分 钟重新引入灌注液。使用流式细胞仪建立的每个iRBC子群体的清除动力学，表明清除了脾 “原初”环状-iRBC，同时先前进行约40次脾传代的iRBC则没有清除。“脾原初”群体动力 学的最差的模型还是有残留寄生虫感染量的单室。来自两个独立实验的平均(个体数值) AIC和半衰期与前面6个“循环”实验( )观察的结果相似。对于“脾传代”群落的最差模 型是没有清除的残留寄生虫感染量(参见表1)。图4 人脾中热带疟原虫iRBC沉积的分析。(al-2)对于环状_iRBC(R，PFZ中，RP 中)、裂殖体-iRBC(S，PFZ中，RP中)或红细胞外寄生虫剩余(EER，PFZ中，RP中)毛囊周 区域(PFZ)或红髓(RP)中的平均(SEM) iRBC数目/100个RBC (来自6个离体灌注人脾实 验的平均值，吉氏染色部分，WP =白髓，横杠=50_m)。每个寄生虫发育阶段的典型方面如 插入部分所示(中间柱)。(a3)PFZ或RP中环状-iRBC (R)或裂殖体_iRBC(Q的保留指数 [RI= (a2中的“iRBC数目/100RBC”/(相应实验末期的循环寄生虫感染量)]。保留至少 为1(黑色断线)对应于没有保留。(bl-2)与al-2中相同的方法，但是使用PAS-染色(a =主动脉)。(cl)紫色PAS-染色部分(横杠=5 μ m)，表示红髓静脉窦的基底膜。脾髓中 RBC沉降的工作分类在窦内腔(SL)中，在与窦壁基底膜直接接触的索中(索近腔，CoA), 或者在不接触基底膜的索中(严格意义上的索，Co)。(W)使用cl中定义的RP中RBC沉 积的工作分类，对于环状iRBC的保留指数。(dl-d2)人离体-灌注脾样本的透射电镜，分 别表示内皮间间隙(黑箭头)上游和下游的环状iRBC(白星形)和未感染RBC(黑星形)。 这种布局反映了红髓中RBC从索(Co)到窦内腔(SL)的循环。环状iRBC的无结节基底膜 与窦壁基底膜(白箭头)非常接近。对于图a、b和c :*、**、#分别表示统计学上的显著差 异，ρ < 0. 05，ρ <= 0. 01，ρ < 0. 0001。图5 :iRBC的变形能力。(a)在不同切应力测量的红血球细胞的伸长指数(EI) (al-2)。(U)在30帕斯卡增加寄生虫感染量时培育的环状iRBC和裂殖体iRBC的EI (4个 独立实验的平均值和标准偏差(SD))。在100%寄生虫感染量时环状iRBC的外推EI的平 均值[95%置信区间(Cl)]是0.47 W. 43-0. 51]。(b)在灌注末期处理的脾样本的扫描电 镜。窦壁的腔内视图，显示内皮细胞典型的串状方面，其中含突入窦内腔的核(N)。细胞从 内皮间间隙生出(箭头，横杠=3μπι)。左上方四方形挤压通过内皮间间隙的RBC的显著 变形。图6 在灌注人脾的快和慢循环腔室中的热带疟原虫感染RBC。使用由人志愿者体 内成像提取的循环特征为框架(图1)，用培育的iRBC刺激活体外人脾脏模型中观察结果 的示意图(参见图2-幻。环状和裂殖体iRBC的主要表型特征不同，环状-iRBC在体外未 表现出细胞粘连性质，并且没有可见的表面修饰。在快室中，对应于组织切片上的滤泡周围 区域，只保留了裂殖体-iRBC，而环状和裂殖体-iRBC都保留在慢室中，对应于红髓(b)。这 导致显著不同的清除率。流向慢室的血液比例(10.2% )和在相同的腔室中保留的可保留 环状-iRBC的比例(11%)之间的相似性是惊人的。脾微循环框架的量化尺度很重要。因为，5%的心输出量去往脾，指定的RBC将每20分钟进入脾脏一次。慢室仅占脾血浆流的 10%，相当于脾红血球细胞流的10-20% (依赖于血浆撇取效应的强度“)。因此，指定RBC 的变形能力的性质控制每100-200分钟发生一次。这与健康对照中先前观察到的僵化的加 热RBC 60分钟的半衰期相吻合％。这些先前临床观察的数量级与我们的框架完美吻合。图7 (al-6)在120分钟灌注过程中灌注液中热带疟原虫FUP裂殖体_iRBC( Δ三 角)和环状_iRBC( ·圆点)的寄生虫感染量(6个独立实验)。图8. (a)使用来自成年非洲患者的超免疫血清池(1/100稀释)，对于为实验制 备的培育裂殖体-iRBC(al)和环状_iRBC(a2)群体进行的表面免疫荧光，并用Hoechst 计数染色。典型的吉氏染色部分如插入部分所示。大多数裂殖体-iRBC可强烈染色，而 环状-iRBC未染色(横杠=ΙΟμπι)。(U)来自表面碘化的培育裂殖体-iRBC(Q和环 状-iRBC(I )的Triton-SDS提取物的PAGE自动放射摄影。仅在裂殖体-iRBC提取物中观 察到正确地对应于PfEMPl的^OkDa条带(箭头)。图9.能够用于筛选可增加热带疟原虫环状感染RBC的刚性的化合物的实验步骤 示意图。图10.用多孔通道膜进行的重力驱动过滤常用装置和实验步骤。1.将柱充满过 滤培养基(补加4%白蛋白和5%Plasmion 的RPMI，或补加人白蛋白的PBS) ；2.过 滤前将过滤单元(包含补加溶解白蛋白的悬浮培养基)阻断10分钟；3.将样品(过滤培 养基中血细胞比容为2% -2. 5% )载入柱；4.过滤步骤；5.从过滤单元的上游和下游取得 样本；6.处理样本用于Pf-iRBC浓度和红血球溶解的定量。图11.多孔通道膜过滤。A-C，E.使用的过滤单元；A.使用的聚碳酸酯膜的类型； B.膜模具；C.膜；E.与柱连接的过滤单元(不断过滤)；D.在穿过Merlitech。聚碳酸酯 膜时RBC的理论性状改变；F.在分别通过2和3 μ m宽通道连接的膜下游的样本的上清液 颜色。2 μ m样本表现出温和至中等的红血球溶解。图12和13.珠层过滤。A.珠来源；B.用于保持珠层的吸头(Barrier吸头1000 ； Neptune) ；C.在倾析前(Cl)和倾析后((^)用尺度减小的珠载入吸头；D.吸头中珠层的示 意图；E. 7-mm 5_25珠层的图。图14和15.通过自然和人工内皮间间隙时RBC的形状变化。图14. Al.脾红髓中的索(Co)和窦内腔(si) ；A2-3.在通过窦壁时RBC发生挤压 (箭头)(离体-灌注人脾的吉氏染色涂片)。B和C.在离体-灌注人脾中从索到窦内腔 通过内皮间间隙时RBC发生挤压(箭头)(投射和扫描电镜)。D1-2.通过聚碳酸酯膜通道 (Dl)或珠间空间(D2)时RBC挤压的示意图。图15. A.在人脾红髓中的内皮间间隙观察到的RBC和内皮细胞(EC;虚线)的形 状(透射电镜)；B.在珠间空间(相同尺寸的珠的混合物)中最窄处的最大直径的几何计
笪弁。图16.用于过滤的注射密封回路参照方法-原理。图17.用于过滤的注射密封回路参照方法-三次过滤的装置。1.具有控制屏幕的 电子注射泵(从左到右)，可显示流量(ml/分钟)、终体积(ml)和压力；2. 3-三通管；3.过 滤膜(箭头)；4.收集管。图18.基于离心的过滤。1. Eppendorf管中过滤单元的装置；2.离心前过滤单元中的上游样本；3.离心机中的过滤单元和Eppendorf管；4.第一轮离心结束时的过滤单元； 5.第一轮离心结束后的收集管(下游样本)。图19.用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法-荧光强度和寄生虫感染量 之间的线性关联，如根据吉氏染色涂片或液相荧光所平行确定的。对10%寄生虫感染量的 培育样品进行梯度2倍稀释的三次重复分析。图20.用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法-基于吉氏染色和基于荧光 对寄生RBC浓度降低(或增加)的估计值之间的线性关联。上游到下游(下半部)或上游 到珠层(上半部)分析。X轴过滤器中的保留率，如根据吉氏染色涂片所估计的；Y轴过 滤器中的保留率，如通过荧光所估计的。图21.来自图20中用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法的子部分-上 游到下游保留率的详细分析，确证寄生虫阶段对于过滤器中保留具有强烈依赖性。X轴过 滤器中的保留率，如根据吉氏染色涂片所估计的；Y轴过滤器中的保留率，如通过荧光所 估计的。
具体实施方式
本发明涉及筛选能增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球 细胞(RBC)刚性的化合物的方法，所述方法包括或由下述步骤组成a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均 在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试化合物增加且具体为选择性增加受 感染RBC(iRBC)的刚性的能力，和；b)测定在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力，和不存 在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，c)可选地，测量在存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力， 和不存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下 培育的iRBC的变形能力下降至少5%，优选至少10%，并且更优选至少15% (具体地，刚性 增加至少5%，优选至少10%，并且更优选至少15% )，则表明所述化合物能增加iRBC的刚 性。在具体的实施方案中，所述筛选方法包括或由下述步骤组成a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育 均在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试化合物增加且具体为选择性增加 iRBC刚性的能力，和；b)测定下述的变形能力-在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC，-不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC，-在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC，和-不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC，其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下 培育的iRBC的变形能力下降至少5%，优选至少10%，并且更优选至少15%，则表明所述化 合物能增加iRBC的刚性。本文使用的“化合物”可以是任何化学化合物、免疫球蛋白(Ig)、多肽、肽，或其它能增加iRBC刚性的生物治疗剂。化学试剂，在本领域中指“小分子”化合物，其通常是有机、 非肽分子，分子量最高10，000，优选最高5000，更优选最高1000，并且最优选最高500道尔 顿。可以使用已知方法产生Ig，并且Ig可以是示例性多克隆、单克隆、人化或嵌合抗体、单 链抗体或Fab片段。“肽”或“多肽”是两个或更多氨基酸(“肽”是2-20个氨基酸，而“多 肽”是多于20个氨基酸)的任何链，包括天然发生或非天然发生的氨基酸残基和氨基酸残 基类似物，无论是否进行翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。这种化合物可以从任何合 适的来源获得或者由任何合适的来源产生，无论来源是否天然。只要适当，可以通过任何化 学或生物合成技术合成所述化合物。根据特定的实施方案，筛选化合物库。具体地，可以筛选来自Sanofi Aventis的库。根据特定的实施方案，筛选的化合物能与包括其皮质细胞骨架的RBC膜(至少包 括其皮质细胞骨架的iRBC膜)相互作用和/或进入RBC (至少进入iRBC)，特别是穿过RBC 的脂双层(至少是iRBC脂双层)，或者与修饰的脂双层本身相互作用。根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与iRBC相互作 用。通过“选择性地与iRBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与iRBC相互作用并增加其 刚性，而不增加未感染RBC并优选其它类型细胞的刚性。这意味着人们筛选在化合物存在 的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感染RBC 的变形能力相同或者相差小于5%。在特定的实施方案中，通过“iRBC”，或“疟原虫感染iRBC”，在本文表示环 状-RBC (或环状-宿主RBC)和/或配子体-宿主RBC，特别是成熟配子体-宿主RBC。根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与环状-iRBC和 /或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用。通过“选择性地与环状-iRBC 和/或配子体-宿主RBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与环状-iRBC和/或配子 体-宿主RBC相互作用并增加其刚性，而不增加未感染RBC和优选其它类型细胞的刚性。这 意味着人们筛选(1)在化合物存在的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存 在化合物的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力相同或者相差小于5%，和(ii)在化合 物存在的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感 染RBC的变形能力相同或者相差小于5%。根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与环状-iRBC和 /或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用。通过“选择性地与环状-iRBC 和/或配子体-宿主RBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与环状-iRBC和/或配子 体-宿主RBC相互作用并增加其刚性，而不增加配子体阶段iRBC(配子体-iRBC)的刚性，也 不增加未感染RBC和优选其它类型细胞的刚性。这意味着人们筛选(1)在化合物存在的情 况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的裂殖体-iRBC 的变形能力相同或者相差小于5%，和(ii)在化合物存在的情况下培育的未感染RBC或其 它类型细胞的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感染RBC或其它类型细胞 的变形能力近似相同或者相差小于5%。通过“增加iRBC刚性的能力”，在本文表示将iRBC刚性增加至少5%，优选至少 10%和更优选至少15%的能力。化合物增加iRBC刚性的能力可以特别地通过测量在所述
13化合物存在和不存在的情况下培育的iRBC变形能力而评价。因此，根据特定的实施方案， “增加刚性”表示“降低变形能力”和特别地“将变形能力降低至少5%，优选至少10%和更 优选至少15%”。通过“由疟原虫属的原生动物寄生虫感染”，在本文表示包含至少一种疟原虫属的 寄生虫[即，所述原生动物寄生虫的子细胞，其是无性繁殖的结果]的红血球细胞。根据一个实施方案，寄生虫选自下足热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日 疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似蛋形疟原虫、巴西疟原虫、许氏疟原 虫和吼猴疟原虫，优选选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日 疟原虫，和更优选选自下组热带疟原虫和间日疟原虫。在特定的实施方案中，所述寄生虫是热带疟原虫，具体为热带疟原虫的I^lo Alto I菌株。根据特定的实施方案，寄生虫，特别是包含感染RBC的裂殖体已发育成为环状；因 此，所述感染RBC处于环状阶段。具体地，可以收集新鲜的环状-感染RBC (环状-iRBC)，即 少于14小时的环形-iRBC，少于8天或者8天的RBC (优选少于8天的RBC)。可替换地或者渐渐地，RBC可以是配子体-宿主RBC，并且优选成熟配子体-宿主 RBC。可以通过在发育疟原虫寄生虫时人工同步化而筛选环状-iRBC和/或配子体-宿 主RBC。本领域中已知几种方法，例如使用山梨醇或甘露醇处理；用5%山梨醇处理iRBC (例 如37°C 5分钟)引起包含晚期在内的iRBC裂解，并且优先筛选早期环状阶段的iRBC。可 以重复处理(至少两次，例如，2、3、4或5次或者多于5次)，例如在34小时后，以进一步筛 选早期阶段并促进同步化。其它技术包括分离晚期阶段寄生虫，例如在Plasmagel或结冷 胶中沉降。因此，在一个实施方案中，本发明的筛选方法的步骤a)后面进行iRBC培育物的 同步化的步骤。根据一个实施方案，RBC(未感染和/或感染RBC)是人RBC。还可以使用来自灵长 类猿猴的RBC，但是更优选使用人RBC。所有血型的人RBC都适合于疟原虫生长，并且特别 适合于热带疟原虫生长。0型RBC特别适用，因为它们与所有其它血型的人血清或血浆相容。进行的筛选可以是低通量筛选或高通量筛选。可替换地，本发明的筛选方法可以 包括低通量筛选的一个或几个步骤和高通量筛选的一个或几个步骤。可以将RBC或iRBC变形能力定义为在微循环期间不破裂或损失完整性而发生充 分变形的能力，和承受动脉循环切应力的能力。因此，RBC和iRBC变形能力的测量是表型测量。可以在群体细胞水平和/或个体 细胞水平进行。因此，本发明的筛选方法包括在群体细胞水平变形能力分析的一个或几个 步骤和/或在个体细胞水平变形能力分析的一个或几个步骤。为了评价iRBC的变形能力，并且特别是评价环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC 的变形能力，通常在37°C或38°C，在RPMI 1640培养基或补加的RPMI 1640培养基中培育 RBC和iRBC，比如完全培养基(RPMI 1640培养基、碳酸氢盐、25mM谷氨酰胺、0. 2%葡萄糖、 100 μ M次黄嘌呤、10 μ g/ml庆大霉素和10% AB+未活化人血清池)。此外，这些细胞优选 在低氧压力(低PO2)条件(通常为1-5% O2)中培育，例如，在02、3% 0)2和96% N2的气氛下培育。RBC和iRBC可以培育0. 1至10小时，优选1至6小时，并且更优选1至3小时，例 如用待测试化合物培育1、2或3小时。因此，在本发明的筛选方法中，步骤b)在步骤a)之 后可以进行0. 1至10小时，优选1至6小时，并且更优选1至3小时，例如1、2或3小时。通常在(i)去除培育物上清液(例如通过在1500转每分钟离心5分钟)和(ii) 将细胞团在白蛋白的PBS溶液或白蛋白的RPMI溶液中重悬后进行变形能力分析。已经提出了测量RBC变形能力中的各种技术，特别是激光衍射术、检电术、微流 体、微量吸管吸引术和光钳的使用。因此，根据一个实施方案，通过检电器、激光衍射器、微 流体设备(特别是毛细管微流体系统)、微量吸管和/或光钳测量RBC和iRBC的变形能力。激光衍射器在各种切应力水平下使用激光衍射分析。这种技术与其它技术相比有 几点优势，它的操作相对简单，具有可接受的精确度，能在各种切应力操作，并且能使用极 小量的血液(少于50 μ 1)快速测量细胞变形能力。自动化的激光衍射器市场有售。在本 发明的筛选方法中可以使用的模型包括LORCA(激光辅助光旋细胞分析仪；Mechatronics， Hoorn, Netherlands)和 RHEODYN-S SD(Myrenne, Roetgen, Germany)。激光衍射器使用激 光衍射仪和图像分析，通过测定流体切应力下细胞的伸长指数值而提供对细胞变形能力的 测量。处理RBC以增加切应力并记录通过悬浮液时的激光衍射模式。随着切应力值增加， 激光衍射模式从圆形变成椭圆形。根据这些测量结果，可以获得细胞的伸长指数。根据特定的实施方案，用于测量RBC和iRBC变形能力的激光衍射器是商业旋转类 型的激光衍射器，L0RCA。使用这种激光衍射器，将RBC的粘性悬浮液在两个同轴圆柱体之 间剪切。如实例部分所示，一个圆柱体的旋转引起RBC的变形(伸长)。用摄像机检测激光 束衍射模式并通过计算机将其转化为数字值，伸长指数(EI)，而进行分析。因此，在一个实施方案中，并且特别是当使用激光衍射器时，参照伸长指数(EI) 进行变形能力的测量。这种度量，其通常定义为椭圆体衍射模式的两个轴之间的差和这两 个轴的和的比例，通常使用椭圆拟合程序根据衍射模式中的强度曲线而确定。在群体细胞 水平分析变形能力时，用于测量RBC变形能力的技术经常得到平均值的指标。此外，在一个实施方案中，并且特别是当使用激光衍射器时，RBC和iRBC的变形 能力，并且通常是伸长指数，通常在0至35帕斯卡(Pa)的切应力范围内测量，优选0.3至 30Pa,例如1. 7Pa至30Pa,并且特别是在1. 7Pa和/或30Pao根据特定的实施方案，iRBC的寄生虫感染量水平为细胞群体的至少20%或30%， 优选细胞群体的至少50%，和更优选细胞群体的至少70%。通过“寄生虫感染量(parasitemia)”，指用培育物中包含至少一个环状或配子体 的RBC的百分比表示的寄生虫的数量含量。可以计数寄生虫的数量，例如，使用光学显微 镜，在薄血液图片(对于高寄生虫感染量)或厚血液斑点(对于低寄生虫感染量)上计数。通常，并且特别是在群体细胞水平测量RBC和iRBC变形能力的时候(例如当使用 激光衍射器时)，在不同寄生虫感染量(至少两个不同寄生虫感染量)测量EI，例如对于环 状-iRBC为4%至76%寄生虫感染量，并且外推至100%寄生虫感染量。根据一个实施方案，对于在存在待测试化合物的情况下培育的iRBC，在外推至 100%寄生虫感染量时，在30 ，低于0. 43的EI，更优选低于0. 42的EI，则表明所述化合物 能增加iRBC刚性。
通过用iRBC的培育物，特别是用包含裂殖体阶段的iRBC的培育物感染(或再 次感染)所述RBC可以在RBC(未感染或已经感染的RBC)的培育物中诱导或增加寄生虫 感染量。可以将裂殖体阶段的iRBC富集在iRBC培育物中，例如通过悬浮在凝胶状溶液 (plasmion 处理)中或通过本领域已知的其它技术，特别是使用细胞分离液梯度。根据特定的实施方案，本发明的筛选方法的步骤a)中使用的iRBC群体已经通过 用iRBC培育物，并且特别是其中例如通过plasmion 处理已经富集了裂殖体阶段iRBC的 培养物，感染未感染RBC，特别是新鲜的未感染RBC( S卩，小于8天或8天的RBC，优选小于8 天的RBC)。因此在特定的实施方案中，使用仅用于培育而不进行任何其它处理的iRBC测量 变形能力。因此，根据特定的实施方案，本发明的筛选方法包括或由下述步骤组成1)富集iRBC培育物中的裂殖体阶段iRBC，例如通过plasmion 处理或通过本领 域中已知的任何其它技术富集；2)用步骤1)的裂殖体富集iRBC培育物感染RBC，特别是新鲜RBC( S卩，小于8天 或8天的RBC，优选小于8天的RBC)(这第二步可以获得环状阶段的iRBC)；3)培育步骤2、获得的iRBC，并且，可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在 存在和不存在待测试化合物的情况下进行，所述化合物用于测试其增加iRBC刚性的能力， 和；4)测量在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC和在不存在所述化合 物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，5)可选地，测量在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC和在不 存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC的变形能力，其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC的变形能力相比，在存在化合 物的情况下培育的iRBC的变形能力降低至少5 %，优选至少10 %，并且更优选至少15 %，则 表明所述化合物能增加iRBC的刚性。这种筛选方法的实例在实例部分中给出(参见实例B)。此外，在上述特定的实施方案中，iRBC培育物的寄生虫，特别是裂殖体富集的 iRBC培育物的寄生虫可以通过本领域任何已知的方法同步化，特别是通过本文所引用的任 何同步化方法，例如通过一次或几次0、3、4或5或多于5次)山梨醇处理。所述同步化步 骤或至少一个同步化步骤优选在裂殖体-富集步骤前进行。根据一个实施方案，本发明的筛选方法进一步包括用离体灌注人脾模型和/或离 体灌注猪脾模型确认筛选的化合物的步骤。所述进一步的步骤通常在变形能力分析的步骤 后进行。根据本发明的特定实施方案，在上文公开的筛选方法中，使用本文定义的用于过 滤RBC的方法进行RBC或iRBC变形能力的测量，优选参照RBC或iRBC保留率或保留比例 (如后文所述)。本发明还涉及本发明的筛选方法的应用，用于筛选选择性地与iRBC相互作用或 选择性地与环状-iRBC相互作用和或与配子体-宿主RBC(特别是与成熟配子体-宿主RBC) 选择性地相互作用并适合增加其刚性的化合物。本发明还涉及用于过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异常具体为降低的变形能力的RBC保留，所述方法包含或由下述步骤组成a)使包含RBC的样品流过过滤单元；和b)取得流过过滤单元之前所述样本的等分试样(上游等分试样)和流过过滤单元 之后所述样本的等分试样(下游等分试样)；和c)可选地取得已经在过滤单元中保留的RBC (保留等分试样)；和d)可选地分析上游和下游等分试样和，可选地，保留等分试样，并且特别地确定上 游和下游等分试样，和，可选地，保留等分试样中RBC或RBC子群体的浓度或密度。本发明用于过滤RBC的方法在过滤单元中使通常可在脾中体内保留的RBC保留， 并因此产生体内发生的脾过滤功能，特别是在人体内发生的脾过滤功能。通过“降低的变形能力”，(或增加的刚性或僵化)，在本文表示变形能力的部分或 全部损失。变形能力通常降低至少5%，优选至少10%和更优选至少15%。在本发明的特 定实施方案中，“降低的变形能力”表示“增加的刚性”。通常将取得的上游、下游和保留等分试样放在微孔板中。密度的确定可以通过自 动化方法平行地对上游和下游等分试样进行。在特定的实施方案中，用于过滤RBC的方法的步骤d)还包括计算过滤单元中RBC 或RBC子群体的保留率(即，保留的RBC或RBC子群体的百分比)，例如使用下述公式(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或RBC子群体 的密度)/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度可替换地，方法可以包括比较下游和上游中RBC或RBC子群体的密度的步骤，例如 通过确定保留比例(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或 RBC子群体的密度)进行比较。在特定的实施方案中，步骤d)包括确定上游和下游等分试样，和，可选地，保留等 分试样中的红血球溶解，例如通过从离心后的上游和下游等分试样，和，可选地，从离心后 的保留等分试样定量上清液中的人乳酸脱氢酶(LDH)浓度而进行。在本发明特定的实施方案中，RBC是人RBC。包含具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的样品优选用于本发明的过滤 RBC的方法中。这些RBC包括受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC、加热RBC和来自患 有遗传或后天的免疫障碍以及遗传或后天的RBC疾病的患者的RBC，并且优选来自患有遗 传性或后天的疾病的患者的RBC，例如遗传性或后天的球形细胞增多症、椭圆形红细胞增多 症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶 血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球细胞 酶)1。在特定的实施方案中，步骤d)中分析的RBC或步骤d)中分析的至少一个RBC子群 体是异常RBC或疟原虫感染RBC(iRBC)，和特别地环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC， 例如成熟配子体-寄生iRBC。当分析iRBC，和特别是环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC时，步骤d)通常包 括或由下述组成-确定上游和下游等分试样，和，可选地，保留等分试样中的寄生虫感染量百分比； 和
-可选地(i)使用下述公式确定过滤单元中的RBC保留率(下游等分试样中的寄 生虫感染量百分比-上游等分试样中寄生虫感染量百分比)/上游等分试样中寄生虫感染 量百分比或(ii)保留比例(下游等分试样中寄生虫感染量百分比/上游等分试样中寄生 虫感染量百分比)。在本发明特定的实施方案中，寄生虫选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟 原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟原虫、巴西疟原虫、 许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原 虫和三日疟原虫，和更优选选自下组热带疟原虫(Pf)和间日疟原虫，例如热带疟原虫的 Palo Alto I 菌株。在本发明的特定实施方案中，样品的RBC已经经过(已知或新)化合物的处理，特 别是可能调节并优选增加RBC刚性的化合物，并且例如可以特异性调节和优选地增加iRBC 刚性的化合物(特别是特异性作用于环状-寄生iRBC和/或配子体-寄生iRBC的化合 物)。在本发明的过滤方法中通常使用小体积样本，例如1-100微升积压红血球细胞的 样本。样本通常优选悬浮在悬浮培养基中，其包括、由或主要由补加4%白蛋白和5% Plasmion 或 1 % albumax II ⑧的 PBS 或 RPMI 组成。通过“主要由组成”，在本文表示可以在样本中加入少量成分而不具有显著影响。在本发明特定的实施方案中，已经从血液样本(例如全血样本)并优选从外周血 液样本取得RBC，所述样品先前获得自患者。在本发明特定的实施方案中，未从血液样本获取RBC，但是优选通过稀释血液样本 (例如全血样本)和优选稀释外周血液样本而区的RBC，所述样品先前获得自患者。本发明的过滤方法中使用的RBC和特别是iRBC可以从患者的血液样本收集，所述 患者已经用具有调节和优选如本文所述增加RBC刚性的能力的化合物治疗。例如，可以在 用所述化合物治疗几小时后收集所述RBC。可替换地，或累积地，本发明的过滤方法中使用的RBC和特别是iRBC可以通过体
外培育而获得。特别地，可以在体外接触具有调节和优选如本文所述增加RBC刚性的能力的化合 物后，特别是在存在所述化合物的情况下体外培育RBC和特别是iRBC(例如环状-寄生 iRBC和/或配子体-寄生iRBC)后，收集用药物处理的RBC。当使用包含iRBC的样本时，可以通过用iRBC，特别是用其中已经富集配子体-阶 段iRBC的iRBC培育物，感染RBC，优选小于8天的RBC，制备iRBC培育物，所述富集例如通 过plasmion 处理进行。在本发明的特定实施方案中，过滤单元的孔(或通道)的直径在1至ΙΟμπι之间， 并且优选在1. 85至9. 4 μ m或1至3或1至2 μ m之间，例如直径2 μ m。在本发明的特定实施方案中，过滤单元的通道的厚度小于Μμπι，并且优选小于 5 μ m0在本发明的特定实施方案中，由重力、冲洗(例如通过施加恒压)、吸引或通过离 心驱动经过过滤单元的流动。
过滤单元通常放在柱(例如当经过过滤单元的流动是由重力或冲洗驱动时)或管 (例如当经过过滤单元的流动是由离心驱动时)中。在本发明的特定实施方案中，样品的血细胞比容较低，例如小于5%，和更优选在 2% -2. 5%的范围内。在本发明的特定实施方案中，过滤单元包含或由多孔通道膜组成，例如聚碳酸酯 多孔通道膜。来自Merlitech Corporation的多孔通道膜特别合适，其中通道直径在1至 3 μ m范围内，并且通道长度是M μ m。例如，可以使用来自Merlitech Coporation的2 μ m 宽和Mym厚的聚碳酸酯多孔通道膜。当使用多孔通道膜时，经过过滤单元的流动通常是重力驱动。特别地，步骤a)可 以是重力驱动并在恒压下，例如80-85cm水的恒压，和优选在约34-37°C的温度进行。可替换地，过滤单元可以包含或由一个或几个珠层组成，并且优选锡珠，其中过滤 单元中存在的珠的直径在2-25 μ m或5-25 μ m的范围内，并且其中由过滤单元内的珠间空 间形成的通道(孔)优选在0. 74禾口 9. 4 μ m或1. 85 μ m禾口 9. 4 μ m之间变化。在本发明的特定实施方案中，过滤单元中存在的每个珠层至少厚0.5-10 μ m，过滤 单元中珠的总厚度至少为5mm，优选7mm。例如，厚度至少为5mm和优选7mm的层，由等重的 珠的混合物组成，其直径在5至15 μ m的范围内，并且可以使用直径在15至25 μ m范围内 的珠。在特定的实施方案中，使用直径从5至25μπι的珠的7mm厚的层。在另一个特定的 实施方案中，过滤单元包含直径从5至25 μ m的珠的7mm厚的层和包含小于5 μ m的较小直 径的珠的上层。在过滤单元中，珠层堆积在适于保留珠的过滤膜上，并且其不影响过滤单元 的保留能力。当使用珠层时，通常使用注射压力流或通过离心(例如通过在1500_2500g离心 1-2分钟)实现经过过滤单元的流动。例如，可以使用电泵在8分钟内(即终体积为8ml) 产生经过层的悬浮培养基(例如PBS+1 ^Albumax II)的恒定Iml/分钟流体。压力上限 可以是例如999mbar。可替换地，也可以使用其它技术实现经过过滤单元的流动，并且可以 是，例如，重力驱动。在本发明的特定实施方案中，使用珠层并在恒压下，例如80-85cm水的恒压，和优 选在约20-25°C的温度进行步骤a)。当本发明用于过滤RBC的方法包括取得已保留在珠层中的RBC的步骤c)时，这个 步骤可以例如通过差异倾析(例如，在通过重力倾析1-3分钟的几个步骤后)进行。使用本发明用于过滤RBC的方法，在群体细胞水平上进行RBC分析，特别是iRBC 分析。在本发明的特定实施方案中，步骤d)和具体的RBC密度或寄生虫感染量确定，通 过液相荧光定量方法或在吉氏染色后进行。加热RBC或感染寄生虫的RBC的荧光定量可以 通过分别用PKH-沈或STOR-I染色而进行。通常使用计数器定量荧光强度，例如FLX-800 计数器。本文公开的任何方法可以体外进行。在另一个方面，本发明涉及本文公开的用于过滤RBC方法的应用，其用于筛选能 调节RBC和特别是受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC变形能力，并且特别是诱导或增 加其刚性的化合物，例如在如本文所公开的筛选能增加疟原虫-iRBC的刚性的化合物的方
19法中的应用。在优选的实施方案中，根据增加受感染RBC的保留率或保留比例的能力筛选 化合物。本发明的过滤方法允许进行低通量筛选或中或高通量筛选。在本筛选方法的特定实施方案中，筛选的化合物能与包括其皮质细胞骨架的RBC 膜相互作用(至少是包括其皮质细胞骨架的iRBC膜)和/或进入RBC (至少是进入iRBC)， 特别是穿过RBC脂双层(至少是iRBC脂双层)，或者与修饰的脂双层本身相互作用。在本发明的特定实施方案中，这种用于筛选化合物的方法包括或由下述步骤组 成-将本发明用于过滤红血球细胞的方法用于包含RBC的样品的两个等分试样，其 中只有一个等分试样先前已经接触过待测试化合物，其中要测试化合物调节和优选增加 RBC刚性的能力(未接触的等分试样作为内部对照)；和-比较两个样本等分试样确定的RBC保留率或保留比例，其中RBC保留率的绝对数 值或保留比例之间至少5%，优选至少10%和更优选至少15%的变化说明所述化合物能调 节RBC的刚性/变形能力，并且其中与未接触化合物的样本等分试样所获得的RBC保留率 或保留比例相比，接触化合物的样本等分试样所获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比 例至少5%，优选至少10%和更优选至少15%的增加说明所述化合物能增加RBC的刚性/ 降低RBC的变形能力。在另一个方面，本发明涉及本文公开的用于过滤RBC的方法的应用，其用于筛选 可以选择性与受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(iRBC)相互作用，并且特别 地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC，特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用，并且适 合于调节和特别地增加其刚性(降低其变形能力)和还适合于根据本发明增加这些iRBC 在过滤单元中的保留率或保留比例的化合物。因此，本发明的过滤方法可以用于筛选能特异性地降低环状-宿主RBC和/或配 子体-宿主RBC(特别是成熟配子体-宿主RBC)的变形能力(即，增加刚性)并且因此诱 导、增加和/或加快这些细胞在脾中的保留并可能从循环血液将这些细胞进行脾依赖性的 清除。因此筛选的化合物可用于治疗疟疾。活性定义为化合物诱导或增加过滤介导的iRBC 保留的能力。在另一个方面，本发明涉及本文公开的过滤RBC的方法的应用，用于分离和/或检 测具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的应用，例如用于与异常RBC变形能力和特 别地RBC变形能力降低有关的临床病症的体外诊断/检测。在本发明的特定实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用于分离和/ 或检测来自患者的血液样本中的iRBC和特别是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC (例 如成熟配子体-宿主RBC)，所述患者已经受疟原虫属原生动物寄生虫(例如热带疟原虫) 感染。在本发明的另一个特定实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用于 分离和/或检测与后天或遗传疾病相关的RBC，诊断或预诊断影响RBC变形能力的后天或遗 传疾�。缫糯曰蛞糯那蛐魏煜赴�(即，用于分离和/或检测球形红细胞症)、椭 圆形红细胞增多症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性 状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它 红血球细胞酶)。
在本发明的另一个特定的实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用 于分离具有异常特别是降低的变形能力的RBC进行实验研究。本发明的用于过滤RBC的方法还可以用于分析和/或分离RBC子群体，和特别是 iRBC，特别是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC。在本发明的另一个特定的实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法用于 测试对患者施用的抗疟疾药物的效果。在用药几小时或几天后，对从患者收集的接触药物 的疟原虫感染RBC使用过滤方法，观察到的用药前和用药后取得的疟原虫-iRBC样本的保 留率或保留比例的变化说明药物降低由脾进行的疟原虫-iRBC的变形能力-依赖性的疟原 虫-iRBC保留或消除。最后，因为实验RBC过滤是脾过滤功能最好的替代品，所以可以提供体外分析患 者脾功能的有用的测试基础，并且特别是分析患有遗传或后天免疫障碍以及遗传或后天 RBC疾病的患者脾功能的有用的测试基础。
实施例实施例A.在人脾的慢速、开放微循环中热带疟原虫环状-感染红细胞的保留患者、材料和方法人类志愿者的超声造影。根据下述入选标准招募16名18-50岁健康男性志愿者 无动脉粥样化风险因素(即，动脉压力正常，不抽烟或无抽烟史，血清胆固醇水平正常)，无 腹部外科手术史，无重大健康问题或过去无重大健康问题(体检正常，血清肌酸酐、AST和 胆红素水平正常，和无HIV、HBV和HCV抗体)，通过传统超声和Doppler评价为脾微血管结 构正常，和无红血球细胞疾病的临床或生物症状-包括血细胞数、血清触珠蛋白和血红蛋 白电泳正常。研究得到Necker医院研究审查委员会的批准，书面的知情同意书可从所有 参加人员处获得。以Iml/分钟的恒定注射速率皮下注射超声造影剂(Sonovue。，Bracco, Mi Iano, Italy)。使用 Philips HDI 5000 (Philips US, Bothell, WA, USA)进行超声造影。 使用反向脉冲成像以低机械指数用线性变换器(LlO-幻将脾成像，使微泡破坏降至最小17， 成像在灌注开始后2分钟开始。每次图像获取重复3次，并且将原始数据传送至PC进一 步定量。使用HDILab (Philips US, Bothell, WA, USA)为每个回放片段定量，HDI Lab是考 虑了压缩图并且允许以线性单位定量的软件。根据位于被膜下区域中的感兴趣区域(ROI) 计算信号强度。移动ROI位置，以补偿呼吸移动和皮下假象。将时间-强度曲线导出至 Deltagraph(Red Rock软件，&ilt Lake City，UT，USA)。使用双指数模型拟合数据。使用 数据和模型之间的关联系数估计拟合的质量。人脾的取得。如述7取得并处理脾脏。未修改治疗和外科手术护理，并且获得患 者书面知情同意书。计划由Ile-de-France II研究调查委员会批准。出现与外科手术有 关的30至90分钟的热缺血时，一旦病理学家对脾脏进行了肉眼检查，并且在需要时进行了 实验前切片处理，即可向脾脏主动脉中插管。为转移至实验室，脾脏中充满冷的Krebs-白 蛋白溶液。寄生虫。如述19培育热带疟原虫I^alo-Alto (FUP-CB13)、D10W和FCR-3。重复进行 人无黑色素的黑素瘤细胞(C32)2°的盘选分离(panning)，直至获得多于5个iRBC每个C32 细胞的细胞粘连率。扩增细胞粘连iRBC，并粗略地通过凝胶浮选同步化，直至历时少于16小时发生完全的再侵入，然后储存在液氮中，每份等分试样> :3ml。在脾脏刺激前7天内，将 等分试样解冻，并允许寄生虫再侵入未感染RBC。在脾脏刺激前14小时内，通过凝胶浮选 方法消除环状，并且成熟形式可以在刚刚收集(< 7天)和洗涤过的RBC中再次侵入，获得 2-7%寄生虫感染量的7-40ml积压的RBC，其在导入灌注液前在RPMI中洗涤一次。活体脾灌注。如述7在由受调节暖空气维持在37°C的Plexiglas腔室中进行离 体-灌注脾实验。简而言之，在实验室中(冷缺血时间，60-90分钟)，将脾脏与灌注设备相 连接，并通过将Krebs-白蛋白培养基流量历时40-60分钟从Iml/分钟增加至50_150ml/ 分钟而进行从6-10°C至337°C的渐进式加温。在这个适应阶段，将患者的RBC从脾脏冲 出(在加温末期血细胞比容<0. )。当脾脏温度到达35°C时，加入未感染的0+RBC(最 终的血细胞比容水平为5-10% )并使其循环30至60分钟。使用Ktat设备(Abbott实 验室，abbott Ppark, ILL, USA)，每10-30分钟监控静脉、动脉和储备库中的葡萄糖、Na和 K浓度、02和0)2分压，和？扎在稳态时，关键的生理标志维持在下述范围灌注液流速 0. 8-1. 2ml/克灌注脾软细胞组织/分钟，脾被膜的温度为36. 7-37. 2°C,Na为135_148mEq/ 1，K为4-5mEq/l，葡萄糖4-12mmol/l, pH 7. 2-7. 35，血细胞比容4-10%，而动-静脉氧分 压延迟为60-120mmHg。最后，在将正常RBC冲出5_10分钟后(引入iRBC前的血细胞比容
<0. 2% )，将0. 2-6%寄生虫感染量的> 32小时的裂殖体_iRBC(侵入后40士8小时)和
<14小时的环状_iRBC(侵入后7士7小时)的混合物引入循环系统2小时。在用Hoechst 33342(1 1000 稀释；Molecular Probes, LSR, Becton-Dickinson，France)为 iRBC 染色 后，根据吉氏染色薄涂片或通过流式细胞仪分析而定量寄生虫感染量。使用CELLQuest软 件(B ecton-Dickinson, France)分析数据。寄生虫分阶段和计数。完全如述1固定并处理脾脏组织。脾脏组织内的个体寄生 虫核、细胞质和疟疾色素易于鉴别。根据下述标准划分iRBC阶段。环状-iRBC:浅褐色点 (核)< 1 μ m，薄的蓝色细胞质或灰色圆形区域< 1/2红细胞大小。裂殖体-iRBC 浅褐色 点>lym或>1( )，厚的蓝色细胞质的褐色点彡1/2红细胞大小。红细胞外寄生虫残 余褐色点周围没有红色染料。对于每个脾脏切片，在滤泡周围带和邻近> 3个滤泡的红髓 中计数RBC。选择可以清晰地与白髓相区分的红髓、邻近的滤泡周和红髓进行计数。计数环 状和裂殖体-iRBC并且每个脾脏位于约150张照片(至少4000个RBC)上。透射和扫描电子显微镜。在灌注末期，将脾脏样本(Imm3)在4°C于补加 CaC12(0. 05% )的0. 08M甲次砷酸盐缓冲液中的2. 5%戊二醛和多聚甲醛中过夜固定。 对于TEM，将固定的样本用0. IM甲次砷酸钠缓冲液漂洗三次，用四氧化饿、1. 5%铁氰酸 钾的0. IM甲次砷酸钠缓冲液溶液在室温后固定1小时，并再用0. IM甲次砷酸钠缓冲液洗 涤。将样本通过梯度系列的乙醇浴(25%至100% )并于室温在Epon812/氧化丙烯混合 物中过夜，使样本脱水。在嵌于Epon 812中后，将样本在60°C聚合48小时。使用Leica ultracut UCT薄片切片机制备超薄片，并用在SOkV操作的JEOL 1200 EX电子显微镜检查。 对于SEM，将固定切片在0. IM甲次砷酸钠缓冲液中洗涤三次，每次10分钟，在(w/v)四 氧化饿、1. 5%铁氰酸钾的0. IM甲次砷酸钠缓冲液的溶液中后固定1小时。在25^^50%, 75%和90%梯度系列的丙酮溶液中脱水10分钟(每次)。然后将样品在100%丙酮中脱水 3X10分钟，之后用C02进行临界点干燥。用22nm金钯为干燥的切片镀膜，用在5kV或7kV 操作的JEOL JSM 6700F场发射扫描电子显微镜检查并拍照。用上方的SE检测器(SEI)和下方的二级检测器(LEI)获得图像。RBC变形能力的测量。使用激光辅助光旋细胞分析仪(LORCA ;MeChatr0niCS， Hoorn, The Netherlands)，如前所述21，通过激光衍射器测量RBC和iRBC变形能力。RBC变 形能力的单位，即伸长指数(Ε. I.)，定义为椭圆体衍射模式的两个轴之间差和这两个轴之 和之间的比例。在切应力(0.3至30帕斯卡)的范围内评价红血球细胞变形能力，所述范 围包括1. 7Pa,其近似对应于循环14动脉侧的静脉压力，和30Pa，其在RBC需要挤压通过小 的细胞间间隙时出现在脾的正弦曲线中。红细胞表面免疫荧光试验。如述，进行该试验以检测表面iRBC寄生虫蛋白。从 培育物制备PBS中悬浮的iRBC。用来自过免疫非洲成年人的血清(由P. Druilhe惠赠；用 PBS/1% BSA 1 100稀释)进行RBC表面寄生虫抗原的标记，然后用结合Alexafluor 488 的羊抗人亲和纯化IgG(l 200稀释；Molecular Probes，Eugene，OR)标记。寄生虫核用 Hoechst 33342(1 1000 稀释；Molecular Probes)染色。将玻片插在 Vectashield 培养基 (Vector 实验室，BurIingame，CA)中。使用由 Zeiss Axiovision 软件控制的 Axiocam HRc 照相机，在kiss Axiovert 200M显微镜上获得图像(全部来自Carl Zeiss,Heidelberg, Germany)。iRBC的表面碘化。将先前通过盘选过程在细胞C32上筛选的高度同步化的成熟阶 段iRBC，通过结冷胶浮选技术富集至80 %，然后用新鲜红细胞稀释(即，小于8天或8天的 红细胞，优选小于8天的红细胞)，在下一循环获得约20%的环状-iRBC。使用乳糖过氧化 酶方法μ进行表面碘化。在再侵入后14小时培育停止。依次用Triton X-10,2% SDS 提取蛋白质。如述μ进行样品的蛋白酶处理(TPCK-处理的trypsin和a-chymotrypsin TLCK(Sigma))。在5_17. 5%梯度丙烯酰胺凝胶上分离碘化的样品。使用Kodak Bio Max MSl膜进行自放射线照相。预染色的蛋白质标记物购自Life Technologies (Gaithersburg, Maryland)禾口 NewEngland BioLabs Inc. (Beverly, Massachusetts)。细胞粘连试验。如前所述2°，研究了 iRBC对C32细胞的细胞粘连，其表达推定的 受体分子CD36和胞内粘连分子1 (ICAM-I)。总而言之，在25cm3的细胞培育摇瓶(Corning Incorporated,USA)中制备单层C32细胞。将以5xl06iRBC/ml的浓度悬浮于pH 6. 8的细 胞粘连培养基中的RBC加入细胞培育摇瓶并通气(1 %02,3% CO2和96%队)15秒，并每5分 钟轻轻摇动，在37°C孵育15分钟。在孵育结束时，轻轻将细胞培育摇瓶在RPMI 1640培养 基中漂洗四次。单层固定在甲醇中，用2%吉氏染色剂染色，并通过显微镜检查。计数1000 个黑素瘤细胞上粘连的iRBC的数目。用100个C32细胞上粘连的iRBC数目表示结果。统计分析。我们使用student成对t_测试进行统计分析；ρ值< 0. 05认为显著。 使用 WinNonLin 软件(5. 1 版本；Pharsight Corp.，Moutain View, CA, USA)进行分区数据 分析。结果人脾中的循环腔室使用超声造影在16名志愿者中研究人脾的循环模式。开始注入造影剂后两分钟 (即，一旦获得微泡的稳定浓度)，使用低机械指数脉冲反向成像研究脾脏。除了使用这种 较低的声能外，随着脾脏持续接触超声波束，一定量的微泡被破坏。时间-强度曲线反映了 信号强度的下降(图1，材料与方法部分)。显示出对于16名志愿者中实验延迟的最佳拟
23合的模型包括两个指数项(所有案例中的关联系数R2> 0.96)。双指数函数可以表示为 N (t) = V1 (C0exp (- β⑷)+V^ (B+ (C0-B) exp (- β 2t))，其中第一和第二项分别对应于慢速和 快速流动腔室。Ctl指初始微泡浓度，并且认为在两个腔室中相等。V1和V2表示相对分数体 积(Vi+V2 = 1)，并且^和β 2分别表示每个腔室中的微泡平均粘度。对实验曲线的分析 得到下述数值每个单腔室指数曲线的Y截距(Ylc^PYA)对应于CtlV1和CtlV2，其中l/β工和 1/β2对应于指数-特征时间。在慢室中，慢室的平均(SD，范围)相对分数体积是70.6% (9.6,51.5-84. 4)并且平均(SD，范围)相对分数流量是 10. 12% (4. 40，3. 99-16. 47)(图 1)。总之，这些观察结果强烈支持人脾双重微循环组织的存在(图1)，其中约10%的血液 输入经过慢室流动(图1和6)。通过离体-灌注人脾清除iRBC用处于裂殖体阶段(侵入后40士8小时)或环状阶段(侵入后7士7小时)的高 度同步化寄生虫培育物灌注离体-灌注人脾。对灌注液的连续吉氏染色薄膜显示，循环的 裂殖体-iRBC和出人意料的，环形-iRBC寄生虫感染量迅速降低。在10和20分钟内，裂 殖体-和环形iRBC寄生虫感染量分别降至其初始数值的4. 5% (范围0-12.9)和沈.3% (范围22. 9-35. 4% )(图加)。裂殖体-iRBC的完全清除很迅速，尽管环状-iRBC寄生虫 感染量下降的速率更慢并且到达平台期(图加)。与裂殖体-iRBC相反，环形-iRBC在其表 面既未显示出结节寄生虫蛋白，也未显示出碘化寄生虫蛋白质(图8)，并且在C32人黑素瘤 细胞上和脾组织学检查都未注意到有细胞粘连(数据未给出)(图4)。脾脏刺激揭示的环状-iRBC的不均一性环状-iRBC的部分清除反映它们通过脾脏的较慢循环或其在脾脏中稳定的保留。 为了阐释这个问题，将环状-iRBC制备物分开，一部分立即灌注进入脾脏，而第二部分在 Krebs-白蛋白培养基中保持37°C (对照“脾原初”细胞)。开始灌注后四十分钟(即40次 脾脏传代)，从灌注液收集未保留的细胞。这些“脾传代”和“脾原初”群体各自用不同的 PKH标记、汇集并重新引入脾脏。接着使用流式细胞仪分析来自灌注系统的连续样本(图 3)。“脾原初”环状-iRBC的评价(SD)半衰期(5. 7士3. 1分钟，两次独立实验)与先前6次 试验中观察到的结果相似(参见结果的下一部分“iRBC清除的模型建立”)。相反，“脾传 代”环状-iRBC未清除(图:3b，c)。这表明环状-iRBC事实上由两个不同的子群体组成，一 个保留在脾中而一个流走。环状-iRBC群体的这种与脾脏保留有关的不均勻性在我们的培 育条件下长时间稳定，并且与灌注脾中引入的初始寄生虫感染量无关(图加)。它还与寄生 虫菌株无关，因为用DlO获得了相似的结果。
权利要求
1.筛选能增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(RBC)刚性的化合物的 方法，所述方法包含下述步骤或由下述步骤组成a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在存 在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试所述化合物增加且具体为选择性增加受 感染RBC(iRBC)的刚性的能力；和，b)测定在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力，和不存在所 述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，c)可选地，测量在存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，和不 存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下培育 的iRBC的变形能力下降至少5%，优选至少10%，并且更优选至少15%，则表明所述化合物 能增加iRBC的刚性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述iRBC是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC， 特别是成熟配子体-宿主RBC。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)使用的iRBC通过下述步骤获得-用iRBC，特别是用其中裂殖体阶段iRBC已经富集的iRBC培育物，感染RBC，优选小于 8天的RBC，所述富集例如通过用凝胶溶液例如plasmion 处理而进行。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤a)和/或权利要求3的步骤之前进 行下述步骤-例如通过一次或几次山梨醇处理而进行iRBC的寄生虫或裂殖体富集iRBC培育物的 寄生虫的同步化，。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中-筛选在存在所述化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在所述 化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力相同或者相差小于5%，和-可选地，筛选在存在所述化合物的情况下裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存在所 述化合物的情况下裂殖体-iRBC的变形能力近似相同或者相差小于5%。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中进行的所述筛选是低通量筛选或高通量 蹄选。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中在群体细胞水平和/或个体细胞水平测 定RBC和iRBC的变形能力。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中RBC和iRBC的变形能力通过检电器、激 光衍射计、微流体设备、微量吸管和/或光钳测定。
9.根据权利要求8的方法，其中激光衍射计是商业自动化仪器，优选为激光辅助光 旋转细胞分析仪(LORCA ;Mechatronics，Hoorn, Netherlands)或 RHEODYN-SSD(Myrenne， Roetgen, Germany)，并且更优选 LORCA。
10.根据权利要求8或9的方法，其中RBC和iRBC的变形能力在从0.3至30帕斯卡 (Pa)的切应力范围内测定，包括1. 71 和30Pao
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中iRBC的寄生虫感染量水平是占细胞 群体的至少20%或30%，优选为占细胞群体的至少50%，并且更优选为占细胞群体的至少70%。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中通过参照伸长指数(EI)进行变形能力 的测定。
13.根据权利要求12的方法，其中在100%寄生虫感染量，30 外推时，对于在存在所 述化合物的情况下培育的iRBC，EI低于0. 43，更优选低于0. 42，则表明所述化合物能增加 iRBC的刚性。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述未感染和感染RBC是人RBC。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述寄生虫选自下组热带疟原虫、间 日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟 原虫、巴西疟原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵 形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组热带疟原虫和间日疟原虫。
16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中所述寄生虫是热带疟原虫，具体为热带 疟原虫的I^alo Alto I菌株。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其还包括用离体灌注人脾模型和/或离体 灌注猪脾模型验证筛选的化合物的步骤。
18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中所述筛选的化合物能与包括其皮质细 胞骨架的iRBC膜相互作用和/或进入iRBC，特别是穿过iRBC脂双层，或者与修饰的脂双层 本身相互作用。
19.根据权利要求1至18中任一项方法的应用，其用于筛选选择性地与受疟原虫属原 生动物寄生虫感染的红血球细胞(iRBC)进行相互作用或者选择性地与环状阶段的iRBC和 /或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC进行相互作用，并且适合于增加它们的 刚性的化合物。
20.用于过滤红血球细胞(RBC)的方法，其使具有异常并且特别是降低的变形能力的 RBC在过滤单元中保留，所述方法包含下述步骤或由下述步骤组成a)使包含RBC的样品流过过滤单元；禾口b)取得在流过过滤单元之前所述样本的等分试样(上游等分试样)和在流过过滤单元 之后的所述样本的等分试样(下游等分试样)；和c)可选地取得保留在过滤单元中的RBC(保留等分试样)；和d)可选地分析上游和下游等分试样和，可选地，保留等分试样，并且特别地确定RBC或 上游和下游等分试样和可选地保留等分试样中RBC子群体的密度。
21.根据权利要求20的方法，其中步骤d)还包括计算⑴过滤单元中的RBC保留率， 例如使用下述公式(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或 RBC子群体的密度)/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度，或(ii)过滤单元中的RBC 保留率，使用下述公式下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或 RBC子群体的密度。
22.根据权利要求20或21的方法，其中步骤d)包括确定上游和下游等分试样中的红 血球溶解，以及可选地，确定保留等分试样中的红血球溶解，例如通过定量离心后的上游和 下游等分试样，以及可选地，离心后的保留等分试样上清液中人乳酸脱氢酶(LDH)的浓度。
23.根据权利要求20至22中任一项的方法，其中样品包含具有降低的变形能力的 RBC，特别是选自下述的RBC:-受寄生虫感染的RBC，优选疟原虫属的原生动物寄生虫，和特别为环状-寄生iRBC或 配子体-寄生iRBC，例如成熟配子体-寄生iRBC ；-经加热的RBC，和-来自患者的RBC，所述患者患有遗传或后天的免疫机能障碍以及遗传或后天的RBC疾 病，和优选来自患有下述疾病的患者的RBC 遗传性或后天的球形红细胞症、椭圆形红细胞 增多症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫 溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球酶)。
24.根据权利要求23的方法，其中所述寄生虫选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵 形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟原虫、巴西疟 原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺 氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组热带疟原虫和间日疟原虫，例如热带疟原虫的 Palo Alto I 菌株。
25.根据权利要求20至M中任一项的方法，其中步骤d)中分析的RBC或步骤d)中分 析的至少一个RBC子群体是异常RBC或疟原虫感染RBC (iRBC)，和特别是环状-寄生iRBC 或配子体-寄生iRBC，例如成熟配子体-寄生iRBC。
26.根据权利要求25的方法，其中步骤d)包括或由下述组成-确定上游和下游等分试样中寄生虫感染量的百分比，以及可选地，保留等分试样中寄 生虫感染量的百分比；和-可选地，计算(i)过滤单元中的RBC保留率，例如使用下述公式(下游等分试样中 RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度)/上游等分试样中 RBC或RBC子群体的密度，或(ii)过滤单元中的RBC保留率，使用下述公式下游等分试样 中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度。
27.根据权利要求20至沈中任一项的方法，其中所述RBC是人RBC。
28.根据权利要求20至27中任一项的方法，其中样本的RBC已经接触过化合物，特别 是能调节和优选增加RBC刚性的化合物，和例如可以特异性调节和优选增加iRBC刚性的化 合物。
29.根据权利要求20至观中任一项的方法，其中已从血液样本获得RBC，并且优选获 得自先前从患者获得的外周血样本。
30.根据权利要求观或四的方法，其中RBC先前已经在体外接触化合物，例如，通过在 存在所述化合物的情况下体外培育RBC。
31.根据权利要求20至30中任一项的方法，其中过滤单元的通道的直径在1至10μ m 的范围中，并且优选在1.85至9.4μπι或1至3μπι的范围中，例如直径2 μ m。
32.根据权利要求20至31中任一项的方法，其中过滤单元的通道的厚度小于Mym， 和优选小于5 μ m。
33.根据权利要求20至32中任一项的方法，其中由重力、冲洗、吸引或离心驱动通过过 滤单元的流动。
34.根据权利要求20至33中任一项的方法，其中样品的血细胞比容较低，例如小于.5 %，并且更优选在2 % -2. 5 %的范围内，所述样品优选悬浮在悬浮培养基中，所述培养基 包含、由下述组成或主要由下述组成补加4%白蛋白和5%Plasmion 或1 % albumaxII 的 PBS 或 RPMI。
35.根据权利要求20至34中任一项的方法，其中过滤单元包含或由多孔通道膜组成， 例如聚碳酸酯多孔通道膜。
36.根据权利要求35的方法，其中步骤a)由重力驱动并在恒压下进行，例如80-85cm 水的恒压，并且优选在约34-37°C的温度进行。
37.根据权利要求20至35中任一项的方法，其中过滤单元包含或由一层或多层珠组 成，并且优选锡珠，其中过滤单元中存在的珠的直径在2-25 μ m或5-25 μ m的范围内，并且 其中在所述过滤单元中由珠间空间形成的通道优选在0. 74和9. 4 μ m之间或1. 85 μ m和 9. 4μπι之间变化。
38.根据权利要求20至35或37中任一项的方法，其中过滤单元中存在的每层珠至少 为0. 5-10 μ m厚，过滤单元中珠总厚度至少为5mm，优选7mm。
39.根据权利要求37或38的方法，其中通过过滤单元的流动是压力注射流或通过离心 引起的流动。
40.根据权利要求37至39中任一项的方法，其中步骤a)在恒压下进行，例如80-85cm 水的恒压，并且优选在约20-25 °C的温度进行。
41.根据权利要求20至40中任一项的方法，其中步骤d)和特别是密度或寄生虫感染 量确定通过液相荧光定量方法进行或者在吉氏染色后进行。
42.根据权利要求20至41中任一项的方法在用于筛选化合物调节变形和具体为诱导 或增加红血球细胞(RBC)刚性的能力，特别是受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC刚性 的能力的方法中，例如在根据权利要求1至18中任一项的方法中的应用。
43.根据权利要求42的应用，其中化合物的筛选包括或由下述步骤组成-将根据权利要求20至41中任一项的用于过滤RBC的方法，应用于包含RBC的样本的 两个等分试样，其中只有一个等分试样先前已接触过待测试其调节和优选增加RBC刚性能 力的化合物；和-比较两个样本等分试样确定的RBC保留率或保留比例，其中两个RBC保留率或保留比 例之间至少5%，优选至少10%和更优选至少15%的差异表明所述化合物能调节RBC的刚 性，并且其中与未接触化合物的样本等分试样获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比例 相比，对于已接触化合物的样本等分试样获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比例中至 少5%，优选至少10%和更优选至少15%的增加表明所述化合物能增加RBC的刚性。
44.根据权利要求1至18中任一项的筛选方法，其中RBC或iRBC的变形能力的测量使 用根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法进行，优选参照RBC或iRBC保留率或 保留比例。
45.根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法的应用，其用于分离和/或检 测具有异�：吞乇鹗墙档偷谋湫文芰Φ腞BC，特别是用于实验研究和/或诊断或检测疟原 虫感染RBC是否存在，例如环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC，或者诊断或预知影响 RBC变形能力的后天或遗传的疾�。绾筇旎蛞糯郧蛐魏煜赴�。
46.根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法的应用，其用于患者脾功能的体外分析，和特别是具有遗传或后天的免疫功能障碍以及遗传或后天的RBC障碍的患者脾功 能的体外分析。
全文摘要
本发明涉及筛选能增加受疟原虫属原生动物具体为热带疟原虫(Plasmodium falciparum)的寄生虫感染的红血球细胞(RBC)刚性的化合物的方法。本发明还涉及过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异常具体为降低的变形能力的RBC保留，以此代替脾过滤功能。所述方法具体为分离和/或检测疟原虫感染RBC或与由来自患者的血液样本的获得或遗传性球形红细胞性贫血有关的红细胞，或体外分析患者的脾功能。本发明还涉及所述方法的应用，用于筛选可以选择性与iRBC相互作用或者选择性与环状-iRBC相互作用，并且适合于增加其刚性的化合物，或者涉及所述方法用于过滤RBC，分离和/或检测具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的应用。这种新过滤方法还易于自动化，并且允许进行粘结RBC的清除或浓缩，在遗传或后天的RBC异常(包括疟疾)中具有广泛的实验和医疗应用。
文档编号G01N33/50GK102112874SQ200980129709
公开日2011年6月29日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者吉纳维夫.米隆, 因诺森特.萨福伊奎诺比西, 奥迪尔.普伊杰伦, 弗朗索瓦.拉科斯特, 彼得.戴维, 瓦伦丁.布劳斯, 皮埃尔.A.巴菲特, 纪尧姆.德普莱恩, 纳拉.莫汉达斯, 西尔维.佩罗特 申请人:公共救济事业局-巴黎医院, 国家科学研究中心, 巴斯德研究院, 皮埃尔与玛丽·居里-巴黎第六大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
