专利名称：：多年生固氮植物生物固氮参数b值测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种农学领域对多年生固氮植物从大气中固氮的参数B值进行测定的方法，本发明所述的固氮植物特别指豆科植物，如苜蓿、红豆草、沙打旺等。
背景技术：
：测定生物固氮的方法很多，如氮累积法、乙炔还原分析法、"N整合法、全N差值法、同位素稀释法，等。这几种方法各有优点，也有或多或少的缺点。乙炔还原法缺点是不能直接而准确的获得生物固氮量，不适于长时期田间共生固氮的定量测定,只能短时间内测定固氮酶活性动态，长时间测定时必须考虑到周围环境的影响。同位素稀释法缺点是需要选择参考植物,它会影响固N量的精确性,不会造成很大的测定偏差。选取同一土壤库中吸收养分相似的根系类型,有相似的N素吸收类型和生长速率。15N价格昂贵，测定手段繁琐,易受大气和土壤中"N的干扰。非同位素法缺点是时间较长,需要测定全产,不能估计因减产而造成的试验误差,因氮肥的施用量不同,会影响测定结果。高氮施肥水平导致作物从根、作物吸收的氮减少。15N自然丰度法，又被称为S"N法，是一种新型的测定豆科植物固氮的方法。它较氮累积法、乙炔还原分析法、"N整合法、全N差值法、同位素稀释法有着更明显的优势，在适当的条件下，可以更精确的测定固氮植物的生物固氮量。"N自然丰度法的优点有a.不干扰土壤生态系统或野外植物；b.不需要收集根瘤；c.仅需收集茎叶材料；d.能够估计植株整个生长季内的固氮总量。但其缺点在于固氮植物和非固氮参照植物间"N丰度的差异很�。ǔ５陀�10%。，这样，测量误差和非大气氮源S15N的真实差异变显得很重要。多年生固氮植物，特别是多年生豆科植物，基于其可多次利用的生物学特点，而"N自然丰度法中定量生物固氮所用B值呈季节动态，无可靠值可引用，对其B值动态的测定，可以量化不同年龄多年生豆科牧草的固氮能力，估算豆科牧草对系统氮素产出的贡献量。所测数据对于指导此类植物单播种植，或与禾本科混播，或参加豆科-粮食作物轮作，减少化学氮肥利用，降低农业生产成本，增加农民收益，并利于环境可持续发展均有积极的意义。但现有技术中缺少对具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值的测定方法。
发明内容本发明目的是提供一种对具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值的测定方法。本发明的方法是将经处理去除其中的氮的砂土放置于培养容器中，将待测植物种子种植于砂土内，加足量无氮溶液，以提供植物生长所需的除氮以外的营养，每日按设计量喷洒蒸馏水补充水分，为防止藻类等微生物生长给检测带来的不利影响，可在砂土表面采取防止藻类等微生物生长的措施，待植株开花期刈割取样，样品杀青处理后烘干至恒重，粉碎后测评定出植物样中的"N的自然丰度值，得到B值。本发明的方法实施中，所采用的防止藻类等微生物生长的措施是在砂土表面铺覆一层其表面裹有蜡的砂土层。本发明的方法特别适合于测定豆科植物的固氮参数B值，在对待测植株培养时应当对其进行根瘤菌接种。在本发明中，所使用的砂土最好是石英砂。所用的石英砂粒径最好不大于1毫米。对石英砂处理方法是先将砂土用自来水反复冲洗至水清澈，再用12%(V/V)浓盐酸浸泡一天后，用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗三次。本发明所用的营养液是在每升蒸馏水中含有如下组份K2HP040.087gKH2P040.068gK2S040.349gMgS04'7H200.493gCaCl20.222gFeNa2EDTA0.421g。本发明中，对前述的每升种植营养液中还可添加如下微量元素H3B030.003gMnCl2'4H200.0004gNaMo04.2H200.00003gCoCl2'6H200.00005gZnCl20.00002gCuCl2.2H200.00005g。本发明的测定方法中，对豆科植物在种子出苗后，取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸馏水搅拌，用注射器从根部注射，再次进行根瘤菌接种，每株注射量为10mlo本发明的B值测定方法中所使用的其表面裹有蜡的砂土的制备方法是，是将石英砂进行消毒处理和去除氮处理，然后将石英砂加热，放入适量石蜡，待石蜡融化后与石英砂充分搅拌均匀，石蜡的加入量以石英砂表面光亮且相互不产生粘结为准，再将其搅拌冷却。本发明的优点是1.可以精确测定豆科植物的生长期内的生物固氮量。2.矫正固氮植物在无氮基质中产生的分馏部分。3.为农业生产中豆科植物的种植提供理论基�。⒛苡行Ъ跎倩У实氖褂昧浚档团┮瞪杀荆黾优┮凳杖�。4.进一步提供禾豆科牧草轮牧及混播条件下的基础理论数据，使其更具农业生产优势。具体实施例方式以下提供本发明的一个实施例，这一实施例是以多年生植物紫花苜蓿为待检测植物。选取颗粒饱满的紫花苜蓿种子500粒，用0.5%NaClO消毒30分钟后自来水冲洗再用蒸馏水洗净，用根瘤菌对种子进行浸泡接种24h处理，然后置室内自然晾干待用。本实施例中所用的根瘤菌均为商业购买的苜蓿根瘤菌。选取石英砂两桶，自来水洗至清澈见底即可，再用浓盐酸将石英砂浸泡一天，然后用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗三次，以确保实验中无外源氮的进入。取直径15cm的小桶9个，各桶下钻均匀分布的小孔，将洗净砂子装入小桶内，砂子高度约20cm，滤去砂子中多余的水分，在小桶下置直径约25cm小盆。将消毒过的苜蓿种子均匀播于桶内砂子表面，用于无氮培养溶液的添加和补充，生长初期用无氮营养液浇透，并使无氮营养液从小桶中漏入桶下的小盆内达适当的高度，使小桶底部的砂与液面相接触。生长初期所用无氮营养液是用蒸馏水将全浓度营养液稀释到1/10的液体，然后每日以蒸馏水补充蒸发的水分，在植株生长的3周间隔至12周逐渐过渡到完全浓度的营养液，每周更换营养液。为防止营养元素富集对植物生长造成毒害等负面影响，需每月一次用蒸馏水淋洗桶内石英砂一次。培养15周至植物花期，用喷壶在表层喷洒蒸馏水至表层砂子湿透，置于温室培养一周。一周内，每日喷洒蒸馏水两次，早晚各一次。所用的全浓度营养液由每升蒸馏水含如下成分构成0.087g，KH2P040.068g，0.349g，MgS04-7H200.493g，0.222g，FeNa2EDTA0.421g，0細g，MnCl2.4H200.0004g，K2HPQK2S04CaCl2H3B03NaMo04.2H200.00003g，CoCl2.6H200.00005g，ZnCl20.00002g，CuCl2'2H200.00005g。配制营养液组份时各组份误差不大于所使用天平误差即可。在植物生长过程中石英砂表层会生长藻类，藻类对养分需求会导致测定的不准确性。为避免这种情况发生，在出苗后在砂表层撒一层约0.5cm其表面裹有蜡的砂进行覆盖，通过石英砂裹蜡处理后铺于表面，既可防水又可遮光，可杜绝藻类的生长。其表面裹有蜡的砂土的制备方法是先将石英砂进行消毒处理和去除氮处理，然后将石英砂加热，放入适量石蜡，待石蜡融化后与石英砂充分搅拌均匀，再在搅拌下将其冷却，石蜡加入的量以石英砂表面光亮且相互不产生粘结为准。在苜蓿种子出苗后，可再次进行根瘤菌接种，其做法是取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸馏水搅拌，用注射器向植株的根部注射，注射量约为10ml/株。在植株初生长的两月以内，共进行8次接种，以确保接种成功。在整个的实验过程中，温室控制在温度25。C士5i:，光照昼夜16h/8h，光照为10120LX，并保持实验室良好通风。待测植株培养15周至植物花期，刈割地上部分植物，烘干粉碎，置4。C冰箱保存，同位素质谱仪测定15N自然丰度固氮百分率，即B值，对已割植株继续按以上方法进行培养，可获长期B值动态。实测值见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上方法用于对红豆草、沙打旺等其他的多年生豆科植物B值测定，可分别测出这些植物不同生长时间的B值。权利要求1.具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征将经处理去除其中的氮的砂土放置于培养容器，将待测植物种子种植于砂土内，并在砂土表面采取防止藻类等微生物生长的措施，加足量无氮溶液，以提供植物生长所需的除氮以外的营养，每日按设计量喷洒蒸馏水补充水分，待植株成熟后刈割取样，样品杀青处理后烘干至衡重，粉碎后测评定出植物样中的15N的自然丰度值，得到B值。2.根据权利要求1所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征是在砂土表面采取的防止藻类等微生物生长的措施是在砂土表面铺覆一层其表面裹有蜡的砂土层。3.根据权利要求2所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征是测定的植物为豆科植物，在对待测植株培养时对其进行根瘤菌接种。4.根据权利要求3所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征是所用的砂土是粒径小于1毫米的石英砂，处理方法是先将砂用自来水反复冲洗至水清澈，再用体积比为12%的盐酸浸泡一天后，用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗三次，所用的营养液是在每升蒸馏水中含有K2HP040.087g/KH2P040.068gK2S040.349gMgS04.7H200.493gCaCl20.222gFeNa2EDTA0.42lg。5.根据权利要求4所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征是所用的每升营养液中还有H3B030.003gMnCl2-4H200.0004gNaMo04.2H200.00003gCoCl2.6H200.00005gZnCl20.00002gCuCl2.2H2000005g。6.根据权利要求3或4或5所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法，其特征是根瘤菌接种是在种子出苗后，取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸馏水搅拌，用注射器从近根部注射接种，每植株注射量为10ml。7.权利要求2至6所述的任一具有固氮特性的多年生植物生物固氮参数B值测定方法中所使用的其表面裹有蜡的砂土的制备方法，其特征是将石英砂进行消毒处理和去除氮处理，然后将石英砂加热，放入适量石蜡，待石蜡融化后与石英砂充分搅拌均匀，再在搅拌下将其冷却，石蜡加入的量以石英砂表面光亮且相互不产生粘结为准。全文摘要本发明公开一种农学领域对多年生固氮植物从大气中固氮的参数B值进行测定的方法，本发明所述的固氮植物特别指豆科植物，如苜蓿、红豆草、沙打旺等。本发明的方法是将经处理去除其中的氮的砂土放置于培养容器内，将待测植物种子种植于砂土内，并可在砂土表面采取防止藻类等微生物生长的措施，加足量无氮溶液，以提供植物生长所需的除氮以外的营养，每日按设计量喷洒蒸馏水补充水分，待植株开花期刈割取样，经杀青处理后烘干至恒重，粉碎后测评定植物样中的<sup>15</sup>N的自然丰度值，得到B值。文档编号G01N33/00GK101285810SQ20081009879公开日2008年10月15日申请日期2008年5月29日优先权日2008年5月29日发明者杨子文,沈禹颖,王先之,妮陆申请人:兰州大学
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