专利名称：以视黄醇x受体为靶点的药物筛选系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选领域。更具体地，本发明提供了一种以视黄醇X受体(RXR)和孤儿受体(TR3)作为药物靶点的新的筛选药物分子的方法。本发明还提供了用这种方法筛选的药物组合物用于治疗癌症、心脑血管病、糖尿病等多种疾病的方法。
背景技术：
具有视黄醇样活性的化合物的应用技术是众所周知的，在世界许多国家的专利和科学刊物上都有所记载。视黄醇样活性化合物已广泛应用于治疗人类以及动物的多种疾病，包括用于预防和治疗癌症和癌前期病变，如乳腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、结肠癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、肺癌、喉癌、口腔癌、血液和淋巴系统肿瘤，用于治疗组织非典型增生、发育障碍、粘膜白斑病、粘膜乳头瘤以及卡波西肉瘤。视黄醇样活性化合物还参与对代谢紊乱的调节，被应用于对II型糖尿病、高脂质血症和动脉硬化症的治疗。
视黄醇样活性化合物的作用通过两类核受体介导，这两个受体家族分别命名为视黄酸受体(RAR)和视黄醇X受体(RXR)，每种受体又各有α、β和γ三种亚型。RAR和RXR两类蛋白结合DNA的C区高度保守，主要区别在于配体结合E区的氨基酸序列差异，同源性低于27％；各种亚型之间区别主要在于A/B区的氨基酸序列差异。
RXR除可形成同源二聚体(Homodimer)外，还可和I型核受体成员形成异源二聚体，包括维生素D受体(VDR)、过氧物酶体增殖激活受体(PPAR)、甲状腺激素受体(TR)以及多种孤儿受体，如肝X受体(LXR)、胚胎X受体(PXR)、持续激活受体(CAR)和孤儿受体TR3/Nur77/NGFI-B(Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，etal.，Cell，1995，83，841-850)和RAR、甲状腺素受体(TR)、维生素D3受体(VD3R)等核受体形成异源二聚体(Heterodimer)，以二聚体的形式与靶基因结合，激活或抑制特定基因的转录活性，形成能够广泛调节基因转录活性的转录因子库。
RXR和RAR的DBD区高度同源说明它们能调控一些相同的基因转录，但它们的特异性配体产生的不同生物活性可能与RXR-RXR、RAR-RXR调节不同基因表达有关，尤其RXR可与其它调节生长发育的核受体蛋白形成异源二聚体，广泛调控核基因的表达活性，因而RXR的激活可能作为体内调节细胞生长发育的一个非常重要的环节。
RXR调控它的异源结合链的转录活性的作用机制已被广泛研究(Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，etal.，Cell，1995，83，841-850；Zhang，X.K.，et al.，Nature，1992b，358，587-591)。近年来对RXR研究的重要进展是发现了RXR在与其他核受体结合形成异源二聚体后可从细胞核中迁出，定位到细胞质的线粒体上，引起细胞色素C释放，参与对细胞凋亡的调控，这一发现具有重要的意义，可能具有可应用于治疗多种与凋亡相关的疾病。
孤儿受体TR3(也称nur77和NGFI)是另一类核受体，TR3和它的近亲家族成员NOT-1(也称Nurr1和RNR-1)和NOR-1(也称MINOR和TEC)在核家族内组成一个引人注目的亚家族(Chang，C.，et al.J Steroid Biochem，1989，34，391-395；Zhang，X.K.，et al.，Nature，1992b，358，587-591；Hedvat，C.V.，et al.，Mol Endocrinol，1995，9，1692-1700；Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，et al.，Cell，1995，83，841-850)。TR3是一种瞬时早期反应基因，它的表达可被许多细胞外刺激因素如生长因子和佛波酯等迅速诱导，并作用于特异的DNA反应元件(NBRE或NurRE)调控靶基因的表达，参与调控细胞增殖和分化(Wilson，T.E.，et al.，Science，1991，252，1296-1300；Phillips，A.，et al.，Mol Cell Biol，1997，17，5946-5951)。近年来另一个重要发现是TR3还可从细胞核迁出，调节多种重要不同的生物学功能，例如，用NGF处理PC嗜铬细胞瘤细胞，TR3可从细胞核转移到细胞质中，有利于NGF诱导的PC12细胞分化。在其他细胞中，TR3从细胞核转移到细胞质定位于线粒体，可诱导细胞色素C释放，从而促进细胞凋亡(Li，H.，et al.Science，2000，289，1159-1164)，提示TR3又可能是一种潜在的凋亡前分子(Maruyama，K.，et al.，Cancer Lett，1995，96，117-122)。进一步发现，TR3可与RXR形成异源二聚体(Forman，B.M.，et al.Cell，1995，81，541-550；Perlmann and Jasson，Gene Dev，1995，9，769-782)，并可与孤儿受体COUP-TF(Wu et al.，Embo J，1997b，16，1656-1669)相互作用。由于COUP-TF与RARβ启动子结合，可使RARβ高效表达(Lin et al.，Mol Cell Biol，2000，20，957-970)，所以，通过与RXR和COUP-TF相互作用，TR3可调节RARβ表达并改变细胞对视黄醇的反应(Wu et al.，Embo J.，1997b，16，1656-1669)。
RXR和TR3从细胞核转移到细胞质中参与调控细胞凋亡有着重要的生物学意义，这一新的作用途径的发现，使RXR和TR3有可能作为重要的药物靶点，其分子模型可用于筛选治疗凋亡相关疾病如肿瘤等新的药物，因而建立RXR和TR3新作用途径的分子模型具有重要的价值。因此，本领域需要寻找新的RXR途径，以便发现和开发作用于RXR介导的途径的治疗剂。
发明内容
本发明的目的就是提供一种以视黄醇X受体(RXR)和孤儿受体(TR3)作为药物靶点的筛选药物分子的方法。
本发明的另一目的是提供含有筛选出的化合物的药物组合物，这些化合物组合可应用于治疗与细胞凋亡有关的疾病。
在本发明的第一方面，提供了一种筛选化合物的方法，所述化合物调控视黄醇X受体(RXR)和孤儿受体TR3从细胞核迁移到以下部位细胞质、细胞膜、线粒体、高尔基体和/或内质网，它包括步骤(a)提供一种细胞，该细胞在细胞核中含有RXR和TR3；(b)在存在或不存在测试化合物情况下培育所述细胞；和(c)选择出调节RXR和TR3从所述细胞的细胞核向以下部位迁移的化合物细胞质、细胞膜、线粒体、高尔基体和/或内质网。
在另一优选例中，所述化合物增加RXR到所述细胞细胞质的迁移。
在另一优选例中，所述化合物减弱RXR到所述细胞细胞质的迁移。
在另一优选例中，所述化合物选自下列物质肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、合成化合物、天然产物、抗体或抗体片段、有机小分子、无机小分子和核酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有用本发明上述方法筛选出的化合物和药学上可接受的载体，而且所述药物组合物通过调控RXR从细胞核向线粒体的亚细胞迁移而影响凋亡。
在本发明的第三方面，提供了一种筛选化合物的方法，所述化合物调控RXR/TR3 II型异源二聚体的形成，从而影响细胞调亡，该方法包括步骤(a)提供一种细胞，所述细胞含有与线粒体相关的Bcl-2家族蛋白，所述细胞还含有能形成I型和II型RXR/TR3异源二聚体；
(b)在存在或不存在测试化合物情况下培育所述细胞；和(c)选出选择性诱导II型异源二聚体形成的化合物。
在另一优选例中，该方法还包含选择调控II型异源二聚体从细胞核向线粒体的迁移的化合物。
在另一优选例中，该方法还包含选择调控II型异源二聚体与Bcl-2家族蛋白结合的化合物。
在另一优选例中，异源二聚体的形成用选自下组的方法鉴别(a)根据所述异源二聚体的构型差别加以鉴别；(b)根据所述异源二聚体的亚细胞定位而被辨认；或(c)对II型异源二聚体特异性的报告基因辨认。
在本发明第四方面，提供了一种药物组合物，它含有用本发明上述方法筛选出的化合物和药学上可接受的载体，而且所述药物组合物通过调控II型RXR/TR3异源二聚体从细胞核向线粒体的亚细胞迁移而影响凋亡。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示共聚焦显微镜的分析结果，表明RXR在药物诱导细胞凋亡时，定位于线粒体。
图2是一系列免疫染色细胞的共聚焦显微镜图像，表明不存在15d-PGJ2时，RXRα转染进入H460肺癌细胞或SY5Y神经真核瘤细胞。然而当细胞用15d-PGJ2处理后，大量RXRα出现在细胞质中。Flag-RXRα的表达载体被转染进所述细胞系后，用15d-PGJ2(5μM)处理细胞3小时，然后用Flag的抗体免疫染色来检测RXRα，用共聚焦显微镜观察Flag-RXRα。
图3是剂量反应分析结果，用竞争结合分析表明15d-PGJ2加入后与RXRα高效结合。15d-PGJ2替代了与RXR配体结合区结合的[3H]9-cis-RA，Ki为1.8μM。细菌纯化RXRα配体结合区蛋白在有或没有所述浓度的15d-PGJ2存在时，与10nM[3H]9-cis-RA一同培育。通过Sephadex G-25脱盐柱洗脱，结合物与放射性分离后，洗脱掉的放射活性用液体scientillation计数测量。
图4是一系列免疫染色细胞的共聚焦显微镜图像，表明非类固醇类消炎药物消炎痛(indomethacin)和二氯芬酸(diclofenac)能诱导RXRα从细胞核向细胞质迁移。将GFP-RXRα和Mito-RFP转染进入cos7细胞，用或不用10-4M消炎痛和二氯芬酸处理细胞4小时，用共聚焦显微镜观察GFP-RXRα和Mito-RFP的分布。
图5显示共聚焦显微镜的分析结果，表明RXR和TR3在药物诱导细胞凋亡时，共同定位于线粒体。
图6是一系列免疫染色的PC12细胞的共聚焦显微镜图像，表明15d-PGJ2与RXRα结合诱导RXRα同源二聚体/单链或TR3/RXRα异源二聚体从细胞核迁移到细胞质。Flag-RXRα和GFP-TR3的表达载体共同或单独转染进PC12细胞，用15d-PGJ2(5μM)处理细胞3小时，用Flag的抗体免疫染色来检测RXRα，用共聚焦显微镜观察Flag-RXRα和GFP-TR3，二者的影像重叠。
图7显示共聚焦显微镜的分析结果，表明RXR和TR3在药物诱导细胞凋亡时，共同定位于线粒体是相互依赖的。
图8是GST pull-down分析的免疫印迹图，表明TR3和RXR形成一个异源二聚体而相互作用。
图9是免疫印迹图，Calu-6肺癌和ZR75-1乳腺癌细胞用或不用trans-RA(10-6M)或15d-PGJ2(5μM)或它们相结合处理24小时，用Western检测RXRβ的表达。
图10是免疫印迹图，表明RXRα/TR3异源二聚体在体外与15d-PGJ2一起培育完全取消了RXRα/TR3异源二聚体与βRARE的结合。体外翻译的RXRα和TR3与15d-PGJ2(10-6M)在有或没有抗TR3或抗RXRα抗体的存在下共同培育15分钟，再与32P-同位素标记的βRARE一起培育，用EMSA分析反应。
具体实施例方式
申请人用多种凋亡刺激因素(如佛波酯(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯，TPA)、消炎痛或diclofenac；临床上已知的抗癌药如5-Fu以及未知化合物SR11247)处理不同的细胞系(LNCap前列腺癌细胞、Cos7细胞、H460肺癌细胞、SY5Y瘤细胞、PC-12细胞、SMMC7721肝癌细胞)，发现这些药物可与RXR结合并诱导RXR从细胞核迁移到细胞质，这些药物通过依赖于RXR的迁移作用诱导细胞凋亡(图1)。
申请人还发现环戊烷前列腺素的代谢产物15-脱氧-12，14-前列腺素J2(15d-PGJ2)新的作用机制。15d-PGJ2在调控炎症过程中具有重要作用，包括抑制NF-KB的激活。另外15d-PGJ2对许多肿瘤细胞系都有抗增殖的作用和凋亡诱导的作用，但其作用机理并不清楚。近来有报道微摩尔浓度的15d-PGJ2结合并激活PPARγ，提示15d-PGJ2可能通过PPARγ起作用。然而各种研究表明15d-PGJ2可能还以不依赖于PPARγ的机理发挥作用。申请人发现15d-PGJ2通过RXR新的作用途径调控多种癌细胞的凋亡(图2、3)。
申请人进一步发现RXR从细胞核迁移出来后能与许多细胞质蛋白相互作用，RXR与细胞质靶点的相互作用能诱导细胞凋亡，其作用不依赖于RXR的转录调控作用(图4)。
申请人还发现某种异源二聚体的形成能诱导RXR从细胞核迁移到细胞质，如在凋亡刺激因素的作用下，形成的RXR/TR3异源二聚体可从细胞核迁移到细胞质。申请人还发现，TR3从细胞核中迁移出来是与RXRα的迁移密切相关的。例如用TPA处理共转染了Flag RXRα和GFP TR3细胞，RXRα和TR3均出现于细胞质中呈点状分布，且与线粒体结合蛋白相互重叠，而对照组二者均位于细胞核。申请人进一步用siRNA技术分别抑制RXRα或TR3在LNCap细胞中的表达，再用TPA处理细胞，无论是RXRα或是TR3均不能从细胞核中迁移出来，提示在药物诱导细胞凋亡时，RXRα和TR3从细胞核迁移到细胞质是相互依赖的(图5～8)。由于TR3/NGFI-B的晶体结构表明TR3/NGFI-B不含配体结合口袋，因此，体外TR3/RXR异源双链的DNA的调节作用不可能由于与TR3的结合。申请人进一步调查了15d-PGJ2与RXRα直接结合的可能性，用[3H9]-cis-RA和RXRα配体结合区的竞争分析结果表明，15d-PGJ2代替[3H9]-cis-RA结合到RXR的配体结合区，Ki为1.8μm，表明15d-PGJ2可直接与RXRα结合。
申请人还发现，RXR/TR3异源二聚体在药物诱导下从细胞核迁移到细胞形成的结构型式与其核内作用于DNA调节基因转录的RXR/TR3异源二聚体不同。
申请人进一步发现，凋亡因素刺激后形成的RXR/TR3异源二聚体通过依赖CRM1的输出方式从细胞核迁移到细胞质，这种输出是一种位于RXR的C-末端的螺旋7的核输出序列(NES)引发的，这种输出序列仅当RXR/TR3异源二聚体是凋亡诱导构型时才能引起CRM1依赖的细胞核输出。
申请人进一步发现，RXRα的细胞核输出序列(NES)位于其C末端的LBD螺旋7。RXRα的晶体结构揭示，RXRα形成同源二聚体或与RAR和PPAR异源二聚体或形成三链结构时，螺旋7发生了显著不同的构型变化(Bourguet，W.，et al.MolCell，20005，289-298；Gampe，R，T.，et al.Mol Cell，2000a5，545-555；Gampe，R.T.，et al.Genes Dev，2000a14，2229-2241)。RXRα的螺旋7的单体结构包含一个α螺旋结构(Bourguet，W.，et al.Nature，1995375，377-382)，由于螺旋7中间的谷氨酸的存在，当RXRα形成同源二聚体或与RAR或PPAR形成异源二聚体或三者形成三链结构时，α螺旋变成π螺旋(Bourguet，W.，et al.MolCell，20005，289-298；Gampe R.T.，et al.Mol Cell，2000a5，545-555；Gampe，R.T.，et al.Genes Dev，2000a14，2229-2241)，申请人发现RXRα与TR3形成异源二聚体时，同样可发生α螺旋(I型，定位于细胞核)向π螺旋(II型，可引起异源二聚体向细胞质迁移)转换，并进一步发现异源二聚体的亚细胞定位与其功能密切相关。
申请人发现在RXRα/TR3异源二聚体中仅RXRαNES被RXR配体结合所调节，如某些RXR的配体(rexinoids)，例如9cis-RA，有效抑制RXRα/TR3异源二聚体作用于线粒体，从而抑制凋亡，而其它一些RXR配体如15d-PGJ2则促进凋亡的发生。
申请人还发现15d-PGJ2能有效抑制多种癌细胞的视黄酸受体β(RXRβ)的表达，但15d-PGJ2的这一作用与PPARγ的活性无关。通过凝胶移位分析，申请人发现15d-PGJ2影响了TR3/RXRα异源双链与βRARE的结合(图9、10)，提示15d-PGJ2是作用于TR3/RXRα异源双链并抑制了该异源双链的活性。
本发明基于申请人发现的一个新的RXR作用途径，该途径涉及RXRα从细胞核到细胞质的迁移，结合对这种新的RXR途径分子基础的理解，用适当的筛选方法，可以发现选择性调控受RXR途径调节的一个或更多功能的化合物。
申请人基于一些新的化合物能调控一种独特的RXR/TR3异源二聚体的形成，并使这种异源二聚体从细胞核迁移到线粒体，作用于线粒体，引起凋亡，进一步发明了新的筛选方法来找出这种新的化合物，因此预测这些调控化合物可激活、增强、抑制、减少或其它方式调节一种独特的RXR/TR3异源二聚体从细胞核迁移到线粒体的化合物的方法。
申请人发现RXR能被诱导从细胞核迁移到细胞质中，并与细胞质靶点相互作用，这可用于发展筛选能调控这种迁移的化合物的筛选方法。申请人发现RXR的一个新颖的非基因引向功能能通过作用于线粒体调控凋亡，这可用于发展调控凋亡的化合物的筛选方法。相似的，申请人发现RXR配体能通过作用于RXRα/TR3异源二聚体的形成和细胞核输出调控凋亡，这可用于筛选调控凋亡的化合物。这些被发现用于调控凋亡的测试化合物都可作为药物组和成分，用于治疗、预防和其它用于调控病理状态如凋亡的方法。
具体的讲，此发明包括找出能诱导RXR从细胞核向细胞质迁移并使RXR与细胞质靶标相互作用的药物。
此发明包括找出能激活、增强、减弱、抑制、逆转、破坏或其它方式调控一种独特的异源二聚体的形成的化合物的方法。
此发明包括找出能激活，增强、减弱、抑制、逆转、破坏或其它方式调控一种独特的异源二聚体从细胞核向细胞质迁移的化合物的方法。
本发明利用它的筛选化合物的方法及使用这种调控化合物的方法，提供了用于治疗凋亡相关异常/疾病状态的调控化合物和含有这种化合物的药物组合物，因此RXR可能代表一种用于发展癌症治疗药物的理想的分子靶标。RXR/TR3凋亡途径异源二聚体代表另一种用于发展治疗癌症和疾病药物的理想靶标。
申请人发现RXR能被许多药物诱导从细胞核迁移出来，并且这种迁移是以细胞质为靶标的如线粒体。一旦RXR位于细胞核外，就与许多能诱导各种细胞途径如凋亡的细胞质靶标相互作用。RXR的这些细胞质作用与通过它的DNA结合作用调控基因表达的传统作用是不同的。
申请人进一步发现在药物诱导细胞凋亡时，RXR受体与TR3受体在细胞核中形成一种独特的异源二聚体。此异源二聚体从细胞核中输出，作用于线粒体，即引发凋亡。此发现导致发明的筛选方法，由此考虑到用于调节所述的发现进而处理和阻止相关情况的化合物的发现，识别和其制剂形式。
申请人发现RXR与TR3结合调节细胞生物学功能至少有两种异源二聚体形式，即I型和II型RXR/TR3异源二聚体，前者于细胞核中特异的DNA反应元件，调节基因的转录，主要参与细胞的增殖，后者则可在某种化合物的诱导下从细胞核迁出定位于线粒体细胞器，所作用的细胞较好是取哺乳动物细胞系，更好的是癌细胞系，最好是LNCaP细胞系。
申请人还发现用文献中的技术调控RXR的亚细胞定位，迁移都是一定的。而那些文献中的常规技术将会用许多这些和其它已知技术来获得此发明的精髓，申请人更好的用免疫染色，免疫印迹分析，可探测标记，和/或与目的蛋白质和肽实用连接的天然荧光蛋白和显微可见技术。
定义此文所用的单数形式“一个”，“和”，“这个”除清楚指明的都包括复数相应事物。例如“一个化合物”指一个或多个这种化合物，而“这个酶”包括一个特别的酶也包括在文献中为人所熟知的其它家族成员和相等物。
一般来讲，随后所用的专门术语和以下所描述的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交的实验步骤都是那些熟悉的在文献中常用的。重组核酸方法、多核苷酸合成、细胞培养、转基因融合(例如电穿孔、显微注射、脂转染法)都使用标准技术。一般酶反应、寡聚核苷酸合成和纯化步骤都是按照产品说明进行的。技术和步骤一般都根据文献中常规方法和文献中提供的各种常规参考书，即Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，N.Y.；and Berger and Kimmel，Methords in Enzymology，Volume152，Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)，Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif.，此专利参考了这些资料。寡聚核苷酸可以根据产品说明书用应用生物系统寡聚核苷酸合成器合成。这些步骤都是文献中常用的，读者很方便得到。所有这些文献在此引用作为参考。
所有这里所提到的“反义”指单链、双链、三链寡聚核苷酸及与RNA转录物或DNA结合的肽核苷酸(PNAS)。来源于基因的转录起始部位如起始位点的-10到+10的区段的寡聚核苷酸，是一个特别的例子。形成反义的三链能与双链DNA相结合而抑制基因转录。反义分子一般100％与意义链互补，但也可能部分互补(少于100％互补，例如95％，90％，80％，70％甚至更少)。反义分子可由基因转录方法或化学合成获得(例如固相亚磷酰胺合成)。反义寡聚核苷酸可能包括L-或D-形式，当给病人用药时为抵抗降解也可适当加以修饰。特例包括5′和3′连锁，它们能抵抗存在于动物体内各组织或体液的核酸内切酶和核酸外切酶的作用。为减少基因的表达，反义核苷酸不要求表达控制元件在体内发挥作用。这种反义分子能被细胞吸收或通过被动扩散进入细胞，也可用载体导入细胞，如病毒载体。然而，反义分子可能被核苷酸编码以至于被翻译，甚至编码这个反义分子的核苷酸可能有效与表达控制元件相连接，使这个翻译分子在细胞内或细胞外表达量得到维持或提高。
术语“探测标记”指在筛选分析中能被选择探测到的任何一部分。如无限制，则包括同位素标记(例如3H，14C，35S，125I，131I)、亲和标记(例如生物素/抗生物素蛋白，链酶抗生物素、抗体结合部位、金属结和部位、表位标记、FLASH结合部位——参见美国专利6,451,569；6,054,271；6,008,378和5,932,474——谷胱甘肽或麦芽糖结合部位)、荧光和冷光部分(例如荧光及其衍生物，GFP，罗丹明及其衍生物，镧等)和酶部分(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)。这种探测标记能在原位进行。例如使用一个非标记主要抗体，而它又能被一个带有探测标记的次抗体所检测。
术语“DNA结合部位”或“DBD”指能与一个特殊DNA序列相结合的蛋白质结构域，包括至少一个锌指序列。
这里所提到的术语“分裂”包含造成RXR-TR3异源二聚体实际上完全分离(例如超过90％分离)的测试化合物。术语“充分分裂”包含造成至少50％结合协同因子与受体分离的测试化合物。
这里所提到的术语“功能上的表达”指一个编码序列，它能被转录、翻译、翻译后修饰(如果有意义)，并置于细胞中，发挥其功能。关于一个报告盒子，功能表达一般指这个所编码的细胞表面受体蛋白充足量的生产，以提供一个具有统计学意义的可探测信号来报告一个报告寡聚核苷酸的转录结果。
这里所提到的术语“LBD”或“配体结合区”指一个核受体的蛋白结构域，正如这里所提到的类固醇超家族受体或其它适宜的核受体，它们与一个生理配体相结合，构型发生变化，与一个结合蛋白的分子间相互作用发生或不发生改变，基于所连接的功能区于是提供了一个可探测的活性。
这里所提到的术语“调控子”指广范围的测试化合物，不仅包括天然的，还包括合成和半合成有机分子、蛋白质、寡核苷酸反义分子和RNAi，即间接或直接影响RXR从细胞核迁移到细胞质的物质。
而且调控子的前体(如能转化成调控子的化合物)也被认为是调控子。与此类似，转化前体为调控子的化合物也被认为是调控子。
“天然荧光蛋白”指能形成高度荧光的，内源的发色团的蛋白，而这些蛋白的形成是通过蛋白质的内源核苷酸的环化和氧化或由于作为荧光协同因子酶的加入。一般这种发色团光谱来自于弱荧光氨基酸例如色氨酸和酪氨酸。内源荧光蛋白已从大量海洋物种中分离并克隆出来，包括海洋三色紫罗兰Renilla reniformis，R.kollikeri和R.mullerei，sea pens Ptilosarcus，Stylatula和Acanthoptilum，还有太平洋西北水母Aequorea Victoria；Szent-Gyorgyi等(SPIE conference 1999；D.C.Prasher et al.，Gene，1992，111229-233)，红荧光蛋白和黄荧光蛋白也从珊瑚中得到了。已得到来源于Aequorea victoria的GFP许多突变体，与天然的GFP相比，它们具有独特的光谱性质，荧光增强，表达提高，在哺乳动物中可折叠(GreenFluorescent Proteins，Chapter 2，pages 19-47，edited Sullivan and Kay，AcademicPress，U.S.patent Nos5,625,048 to Tsien et al.，essued April 29，1997；5,777,079 to Tsien et al.，issued July 7，1998；and U.S.Patent No.5,804,387 toCormack et al.，issued September 8，1998)。在许多情况下这些功能性荧光蛋白比野生型蛋白有着卓越的光谱特点，此发明用它作为报告基因。若无限制，所提及的天然荧光蛋白包括GFP、EGFP、YFP、RFP和DS red。
这里所提到的术语“实用连接”指寡聚核苷酸元件功能关系上的连接。当一个核苷酸与其它核苷酸序列发生功能性关系时即为实用连接。例如，如果一个启动子或增强子影响了编码序列的转录，它就与此编码序列发生了实用连接。实用连接意味着被连接的DNA序列一般是连续的，必须结合两个蛋白编码区，还需是在阅读框内。然而，增强子发挥作用时一般与启动子间隔几个Kb，内含子序列长度也是不同的，因此一些寡聚核苷酸序列可能是实用连接但不是连续的。与一个寡聚核苷酸序列即一个内源基因的转录调控序列实用连接的一个结构基因(如HSVtk基因)的表达实际上与天然发生的基因具有相同时间和相同的凋亡特异性模式。
这里所提及的术语“非类固醇抗炎药”指那些通过抑制前列腺素的产生而抑制发炎的化合物。这些化合物具有抗炎、镇痛、解热的作用。以那些只有抗炎作用的类固醇化合物(例如hydrocortisone或prednisone)作为参照。非类固醇抗炎药是COX2抑制剂例如消炎痛，二氯芬酸，celecoxib naproxen，布洛芬和rofecxib。
这里所提及的术语“核苷酸”和“核苷序列”包括反义核苷序列，RNA分子或aptamer序列。例如一个核苷酸序列如aptamer能与RXR或者RXR/TR3或RXR/Agent复合物的一个或更多组分结合，来调节此复合物的水平和稳定性。Aptamer是具有能与小分子靶标结合的三维构像的核苷酸序列，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、协同因子、氨基糖苷、抗生素、核苷碱基类似物、核苷酸和聚合肽(Jayasena，S.D.，Clinical Chemistry，1999，459，1628-1650)。为了增加这些核苷酸序列在细胞中稳定性，可以用文献中所谈及的几种方法对其加以修饰。
这里所提及的术语“孤儿受体”是核受体超家族成员，其天然配体(激素)还未找到。
这里所提及的术语“拟肽”指非肽化合物，与相应多肽是拓扑类似物。例如这种拟肽仍然保留多肽中具有重要功能的氨基酸的部分或全部功能团。例如这种拟肽也能部分或全部由非肽主链组成，在文献中也如此设计其它拟肽如葡萄糖支架、吡咯烷酮支架、类固醇支架、苯丙二嗪支架等等。拟肽能提供各种多肽没有的优点，由于给药时能稳定通过消化道，因此可口服给药。另外拟肽能设计为更好的通过血脑屏障。
这里所提及的术语“RNAi”指用RNA干扰的方法干扰双链RNA的小分子。RNA干扰是通过转录后RNA降解使得特异性序列基因沉默的过程，这是由于双链RNA(dsRNA)同源物引起了沉默基因序列的产生。双链RNA的一个特殊的例子包含对应于与19个RNA核苷酸杂交的靶基因的有大约21个连续的核苷酸的有意义链和反意义链，在每条链3′末端悬挂两个核苷酸(Elbashir et al.，Nature，2001，411494-498；Zamore，Nat.Struct.Biol.，2001，8746-750)。大约25-30个核苷酸的dsRNAs已被用于RNAi(Karabinos et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，987863-7868)。dsRNA能在体外合成并通过文献中所述方法导如细胞。用这种方法靶多肽的翻译减少。
报告基因包括任何直接或间接产生特异性报告基因产品，可探测标记，酶的一部分或细胞基因型如能监测基因转录的药物赖受性的基因。所提及的报告基因包括有酶活性的蛋白，提供基因表达的酶的扩增，如β-内酰胺酶、虫荧光素酶、β-半乳糖苷酶、催化抗体和碱性磷酸酶。其它的报告基因包括蛋白质如天然荧光蛋白或同源物，细胞表面蛋白或者内源性基因的天然或修饰形式，对于分析这些蛋白的特殊方法已经存在或有待将来发展。
这里所提到的“选择性诱导”指一个细胞群从非凋亡状态到凋亡状态的转换。较好的转换是可检测到凋亡的增加，更好的是凋亡10％的增加，最好的是凋亡是50％的增加。
这里所提到的“处理”或“处置”包括与凋亡作用相关的疾病状态的处理，具体如下a)阻断与凋亡作用相关的疾病状态的发生；b)抑制与凋亡作用相关的疾病状态如阻止它的发展；或c)减少与凋亡作用相关的疾病状态如使状态好转。
这里所提及的术语“转录激活区”指能增强结构序列内含子转录的蛋白质或蛋白域。增强转录的能力可能影响基因可诱导的转录或基因的基础水平转录或两者。例如一个报告多肽可能包含驱使编码一个报告基因的序列的转录的最小的启动子。这种报告多肽可以转入核受体敏感细胞系，用于建立改进的宿主细胞。在凋亡激动剂的存在下使培养细胞的报告基因表达沉默的克隆序列也包括在内(例如减少基础转录和保证可探测的诱导性)。许多其它转录调控元件的特异性例子如特异性最小启动子和报告元件在文献中都有所报道，基于从事者所需应用可选择用于发明方法和寡聚核苷酸结构。在选择用于此发明的适宜转录调控元件和其它结构和功能序列时，参考了文献资源和公布的专利文件，Genbank和其它序列信息数据资源。如果需要，可以根据可得到的序列信息(如美国Genebank序列，反应元件，最小启动子等)，通过寡核苷酸合成(和连接)构建一个转录调控元件。
术语“I型和/或II型”指RXRTR3异源二聚体构型的变化。I型异源二聚体的构型使其定位于细胞核，能与DNA反应元件结合，II型异源二聚体的构型使其能从细胞核迁移到细胞质，与线粒体相结合，触发凋亡。
这里所提到的术语“系统”指完整的有机体和以细胞为基础的系统，包含用于分析反应于这里提到的测试化合物的RXR-TR3异源二聚体II型细胞途径的各种成分。
至于多肽，术语“实际相等”意味着两个肽最适比对时，例如用省略缺口参数通过程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，有至少90％序列相等，更好的至少有95％序列相等。更好的，不相同的残基位置与保守的氨基酸取代不同。保守的氨基酸取代是指有着相似侧链的残基相互替换。例如，一群有着脂肪族侧链的氨基酸是氨基乙酸、丙氨酸、缬草氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一群有着脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和羟丁氨酸；一群含氨基侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一群有着芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一群有着碱性侧链的氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；和一群有着含硫侧链的氨基酸是胱氨酸和甲硫胺酸。更好的保守氨基酸替代群是缬草氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-亮氨酸、谷氨酸-天冬胺酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
由于技术和科学术语不能完全列举出来，任何未限定的术语其意义可理解为此发明引用文献中的意义。关于“限制酶”或“高保真酶”可能包括这种酶和任何其它适合所述标准的酶，或者关于方法则包括参考文献中已知的获得cDNA序列的一种或更多方法或在这个说明中将要读到的方法。
本发明的主要优点在于(a)本发明发现了RXR和TR3的细胞亚定位决定其不同的生物学功能，这一新的发现导致了新的药物筛选系统的方面；
(b)本发明的第二方面是成功地设计并将绿色荧光蛋白GFP连接到适宜地靶基因，不影响靶基因的功能，同时绿色荧光可方便于观察靶基因的细胞亚定位；(c)本发明的第三方面是将红色荧光蛋白RFP连接到线粒体特异性蛋白上(RFP-mito)，利用共聚焦显微镜可方便地观察到感兴趣基因从细胞核迁移出来定位于线粒体上；(d)利用本发明的筛选方法，可以高效快速地筛选获得以RXR和/或TR3为靶点的化合物，利用荧光定位可清楚地发现这些化合物调控RXR和/或TR3的异源双链从细胞核迁移到细胞质中，从而调控细胞凋亡；(e)本筛选方法已成功应用于多种细胞系，并筛选到可引起细胞凋亡的已知和未知的化合物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1在第一种筛选方法中，用各种测试化合物来处理细胞，并分析其RXRα的细胞核输出。
LNCaP(ATCC，Cat.No.CRL-1740)或其它类似细胞，如H460肺癌细胞、SY5Y神经瘤细胞和COS-7细胞首先在96孔、384孔、1536孔或其它容易买到的组织培养板中过夜培养。
筛选可采用以下两种方法。第一种方法是检测化合物对适宜细胞中表达的内源性RXRα迁移的影响。第二种方法涉及标记或未标记GFP、FLAG或myc的RXRαcDNAs的转染。可以用RXRα的抗体检测内源性受体，而转染的受体可以用RXRα的抗体或标记的抗体检测。用标准程序将受体质粒如GFP-RXRα融合表达质粒(或其它标记融合)转染进细胞。根据Li，H.et al.(Science，2000298，1159-64)制备GFP融合表达质粒。转染16小时后，用以下任一方法处理细胞(1)仅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一种凋亡刺激(如对LNCaP细胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入测试化合物。反应板总体积96孔板100μl，24孔板1ml，每种化合物加入量是1-5μl，TPA为100ng/ml，其余预测化合物工作浓度范围在10-5～10-7Mol/L。细胞经处理3小时后，用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤，用4％多聚甲醛溶液固定，然后用适宜的抗体将细胞免疫染色，用MRC-1024MP激光扫描聚焦显微镜观察内源性RXRα的亚细胞定位(BioRad)。比较处理过的细胞受体分布图像和对照细胞的亚细胞定位。用相关蛋白和组织的免疫染色检测是否RXRα迁移到细胞质和线粒体。DAPI染色用于检测细胞核，而线粒体用Hsp60免疫染色检测，内质网用染色的钙网蛋白检测。
实施例2在第二种筛选方法中，用各种测试化合物来处理细胞，并分析RXRα/TR3异源二聚体对线粒体的作用。
首先将LNCaP(ATCC，Cat.No.CRL-1740)或其它类似细胞，如H460肺癌细胞、SY5Y神经瘤细胞和COS-7细胞在96孔、384孔、1536孔或其它容易买到的组织培养板中过夜培养。
筛选可采用以下两种方法。第一种方法是检测化合物对适宜细胞中表达的内源性RXRα/TR3异源二聚体迁移的影响。第二种方法涉及标记或未标记GFP，FLAG或myc的RXRα和TR3 cDNAs的转染。可以用RXRα和TR3的抗体检测内源性受体，而转染的受体可以用RXRα和TR3的抗体或标记的抗体检测。用标准程序将受体质粒如Flag-RXRα融合表达质粒(或适宜的标记受体融合)和GFP-TR3融合表达质粒(或适宜的标记融和质粒)转染进细胞。根据Li，H.et al.(Science，2000298，1159-64)制备GFP融合表达质粒。转染16小时后，用以下任一方法处理细胞(1)仅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一种凋亡刺激(如对LNCaP细胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入测试化合物[反应板总体积是对于96孔板是100μl，对于24孔板是1ml。每种化合物体积是1-5μ1，TPA为100ng/ml，其余测试化合物工作浓度范围在10-5～10-7Mol/L。培育对照组细胞和加了测试化合物的细胞3小时，然后用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤，并固定在4％的多聚甲醛溶液T×PBS中。然后用适宜的抗体将细胞免疫染色来检测RXRα和TR3，用MRC-1024MP激光扫描聚焦显微镜观察内源性或转染的RXRα和TR3的亚细胞定位(BioRad)。比较处理过的细胞受体分布图像和对照细胞的亚细胞定位。用相关蛋白和组织的免疫染色检测是否RXRα和TR3迁移到细胞质和线粒体。用DAPI染色检测细胞核，而线粒体用Hsp60免疫染色检测，内质网用染色的钙网蛋白检测。
实施例3在另一筛选方法中，在存在或不存在RXRα抑制剂的情况下，用各种测试化合物处理细胞，然后分析其对细胞增长和凋亡的影响。这些抑制剂包括但不仅限于siRNA，其作用是抑制RXRα，或者可以用反义TR3。在这个例子中，用RXRαsiRNA。
用含0.5％FBS培养液在组织培养板上培养细胞，瞬时转染GFP-RXRα，构建如实施例1中所述。然后用以下之一处理细胞(1)仅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)TPA；(3)0.5％FBS中的TPA和RXRαsiRNA；(4)测试化合物或；(5)测试化合物和RXRαsiRNA。用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-二苯-四氮唑溴化物)和DAPI(4，6-二酰胺-2-苯吲哚)分析检测细胞增长和凋亡。
与未转染细胞相比，转染了RXRαsiRNA的细胞丧失生长抑制作用，表明化合物的生长抑制作用需要RXRα。
实施例4在进一步筛选方法中，LMB被用于抑制CRM1依赖性的RXRα和RXRα/TR3异源二聚体的细胞核输出。因此在存在和不存在LMB的情况下，用各种测试化合物处理细胞，检测RXRα或RXRα/TR3异源二聚体的亚细胞定位和化合物的生长抑制和凋亡作用。
在组织培养板上培养细胞，瞬时转染或不转染RXRα和TR3表达载体，构建如实施例1中所述。然后用以下之一处理细胞(1)仅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一种凋亡刺激(如对LNCaP细胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入一种凋亡刺激(如对LNCaP细胞用TPA)和LMB；(4)0.5％FBS中的测试化合物或(5)0.5％FBS中的测试化合物和LMB。
按照实施例1将培养板细胞染色并观察，正如实施例1所述检测各个蛋白的亚细胞定方式。用实施例3的方法检测生长抑制和凋亡。
不用LMB的情况下，细胞质定位方式表明测试药物是否引起RXRα或RXRα/TR3异源二聚体的细胞核输出。如果含LMB的培养板显示RXRα或RXRα/TR3异源二聚体的细胞核定位，表明细胞核输出CRM1依赖性的。如果含LMB的培养板显示缺乏生长抑制和凋亡，则表明测试化合物通过RXRα或RXRα/TR3异源二聚体的细胞质定位抑制细胞生长并诱导凋亡。
实施例5在另一筛选方法中，用各种测试化合物处理体外或在细菌中合成的RXRα或TR3蛋白，用凝胶移位分析RXRα/TR3异源二聚体的形成。这种分析将会检测哪种测试化合物能调节RXRα/TR3异源二聚体的形成。在存在或不存在测试化合物情况下培育RXRα和TR3蛋白。随后将混合物与23P标记的β视黄酸反应序列(βRARE)一同培育，用凝胶移位分析RXRα/TR3异源二聚体的结合。9-cis-RA能增强RXRα/TR3异源二聚体与DNA的结合，可用作阳性对照，而15d-PGJ2能阻止异源二聚体的结合，可用作阴性对照。
某化合物增强异源二聚体的结合将表明此化合物有保留RXRα/TR3异源二聚体在细胞核中的作用，可能通过RXRα/TR3异源二聚体的LBD二聚体表面的诱导造成异源二聚体的转录活性。相似的某化合物抑制异源二聚体的结合可能表明此化合物可能通过RXRα/TR3异源二聚体的LBD二聚体表面的诱导造成异源二聚体的细胞核输出。
实施例6在另一筛选方法中，用各种测试化合物处理细胞并分析对线粒体的作用。在这个例子中，在存在和不存在RXR-NES抗体的情况下，用各种化合物处理细胞。这种分析可检测那些引起凋亡的化合物是否是通过RXRα/TR3异源二聚体途径其作用的。
首先将LNCaP或其它类似细胞，如H460肺癌细胞，SY5Y神经瘤细胞和COS-7细胞用96孔、384孔、1536孔或其它容易买到的组织培养板上过夜培养。然后用以下反应混合物之一处理细胞(1)0.5％FBS中的测试化合物；(2)测试化合物和RXR-NES抗体。另外对照板含仅仅FBS，FBS和一种已知凋亡诱导药物如TPA，FBS和RXR-NES抗体，或FBS，RXR-NES抗体和TPA。然后培育混合物，用PBS洗涤，并固定在多聚甲醛溶液中，如实施例1所述。
先用Hsp60抗体IgG，再用Cy3结合IgG抗体对线粒体结合的蛋白Hsp60进行染色(Pharmingen，Cat.No.)。用相似的两步抗体技术对RXR或RXR/TR3染色。收集荧光图像，用MRC-1024MP激光扫描共聚焦显微镜分析，图像重叠。
比较异源二聚体和Hsp60的亚细胞定位。在仅含测试化合物的培养板中，RXRα或RXRα/TR3与Gsp60的重合表明测试化合物激活或增强RXRα对凋亡的调控。在含测试化合物和RXR-NES抗体的培养板中，RXRα或RXRα/TR3在细胞核中的定位，表明测试化合物的凋亡刺激作用通过阻止NES调节的异源二聚体的迁移而被抑制。
实施例7在另一筛选实验中，用荧光共振能量转移(FRET)对诱导RXRα或RXRα/TR3异源二聚体从细胞核向细胞质膜和各种细胞内器官如线粒体，高尔基体和内质网迁移的化合物进行高通量筛选。为研究是否受体迁移到细胞质膜，将一种细胞质膜靶序列如含K-ras的C末端的CAAX盒子与蓝色荧光蛋白(BFP)或适宜荧光蛋白融合。为研究线粒体靶点，将一种线粒体靶序列如果蝇外部线粒体膜蛋白Mas70p的跨膜区与BFP或适合的荧光蛋白融合。为研究线粒体靶点，将一种ER特异性靶序列如细胞色素b5的ER特异性同工型中的ER靶序列，与BFP或适宜的荧光蛋白结合。为研究高尔基体靶点，将一种取自ST3Gal转移酶I的高尔基特异性靶序列与BFP或适宜的荧光蛋白融合。融合质�：虶FP-RXRα或GFP-TR3将被稳定转染进COS-7细胞或其它适宜细胞。稳定表达GFP-RXRα或GFP-TR3和一个BFP融合的克�。们懊婷枋龅腇RET技术，用于高通量筛选诱导RXRα或TR3向细胞质膜或其它细胞内器官迁移的化合物。
药物组合物这里提供此发明中化合物和药物组合物的使用方法。此方法包括用一种依赖于特异细胞类型的方式改变前面所提到的细胞核受体活性的化合物和药物组合物在体内和体外的使用方法。
所讲方法具体就包括凋亡调控化合物的发现和使用。
一旦某化合物被本发明的筛选方法鉴别为调控物，那么该化合物就可制成药学上可接受的形式，如用Remington′s Pharmaceutical Science，18thed.，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990)所述的方法，从而产生可用于治疗疾病和病理状态的药物组合物。
用这里所讲述的方法找出的药物给病人用药，可以单独用药，也可制成混合物，加入适宜的载体或赋形剂，给病人具有有效剂量的药物。有效剂量指引起病人症状改良或生命延长的药物剂量。
药物也可制成药学可接受的盐。药学上可接受的盐包括如那些含氢氯化物、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲醇磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、环己基磺酸盐和奎宁酸的盐。这种盐可能是用酸如氢氯酸、硫酸、磷酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、甲醇磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、环己基磺酸和奎宁酸制成。
用标准技术制备药学可接受的盐。例如，药物的自由碱基形式首先溶于含适当酸的适宜溶剂如水或水-甲醇溶液中。然后蒸发溶液以分离盐。在另一个例子中，在有机溶液中用反应自由碱基和酸的方法制备盐。
载体或赋形剂有利于药物给药，例如，增加药物的溶解度。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙，各种糖和各种形式的淀粉、纤维素、动物胶、植物油、聚乙烯和生理适宜溶液。
可用标准药学方法如用细胞培养或实验动物检测这些药物的毒性和治疗效果，如检测LD50(50％死亡剂量)和ED50(50％有效剂量)。毒性和有效剂量的比例是治疗指数，可用LD50/ED50表示。具有较高的治疗指数的药物比较好。从这些细胞培养分析和动物研究中所得出的数据可推出用于人的剂量范围。这些药物的剂量最好存在于包括小的ED50或没有毒性的范围内。剂量可以根据所提供的剂量和所用的给药途径有所变化。
对于所有用这里所讲述的方法找出的药物，有效剂量的估计可能一开始都来自于细胞培养分析。例如，剂量能在动物模型中形成，以获得包括IC50的循环血浆浓度，正如细胞培养中检测的一样(如检测药物获得蛋白质复合物最大破坏的一半的剂量，或复合物细胞内水平和/或活性最大抑制的一半的剂量)。这种信息可用于更准确的检测人类有效剂量。可检测血浆水平，如用HPLC。
医生可根据病人情况选择适当的药物组合物、给药途径和剂量(See e.g.Finglet al.，in The Pharmacologocal Basis of Therapeutics，Ch.1p.1(1975))。医生应根据毒性、器官功能障碍等决定什麽时候结束、中断或调整剂量。相反的，如果临床剂量不够时(避开毒性)，医生也应该知道调节剂量到较高水平。给药剂量范围应随处理的疾病严重程度和给药途径有所变化。而且，剂量和可能的给药频率也要根据年龄、体重、具体病人的反应情况有所调整。与上述讨论类似的程序也可用于兽医。
根据处理的特殊情况，这些药可系统给药或局部给药，给药方法可参考Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。适宜途径包括口腔、直肠、经皮、阴道、经黏膜或肠内给药；肠外途径包括肌内、皮下、髓内注射和鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于注射的药物可制成水溶液，最好用生理适宜缓冲液如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水。对经粘膜途径给药，制剂应采用适宜载体渗透的穿透方式，这些穿透一般可见于文献。
注意要使用制药可接受的载体，以制成含适于系统给药剂量的药物。选择适宜的载体和生产方案。这些药物，特别是那些以溶液形式存在的药物，可肠外给药，如通过静脉注射。用文献中常见的制药可接受载体，这些药物能容易制成适于口服给药的剂量。这些载体能使此发明的药物制成片剂、胶囊、丸剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等病人能口服吸收的制剂。
细胞内给药的药物可参考文献中常用的技术。例如，这些药物可包裹进脂质体，然后，按以上所述给药。脂质体是球形脂双层膜，内部为亲水性。有脂质体形成时水溶液中的所有分子都包裹进亲水内部，脂包裹物与外部微环境隔绝，由于脂质体与细胞膜融合，因此，脂质体包裹物能有效进入细胞质。另外，由于它们的疏水性，小的有机分子可以直接注入细胞内。
适合用于此发明的药物组成，包括能获得预期目的的有效剂量的活性成份的组成。有效剂量的确定可参考文献，特别可参考此文所述。除了活性成分，这些药物组成还可含有适合的药物可接受载体，其中包含帮助活性药物制备成药学可用的成药的过程的赋形剂和辅助剂。用于口服的成药可制成片剂、糖衣药丸、胶囊或溶液。此发明所述的药物组成可通过已知方式生成，如通过常规混合、溶解、成粒，制成糖衣药丸、悬浮、乳化，制成胶丸，或冻干过程。
用于肠外给药的系统包括以水溶液形式存在的活性药物的水溶液，另外，活性药物的悬浮液可制成适宜的油注射悬浮液，适合的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如乙基油酸酯或三酸甘油酯或脂质体。水注射悬浮液可能包含能增加悬浮液粘度的物质，如羧基纤维素钠，山梨醇或葡聚糖，也可包含适宜的稳定剂和药物，增加药物溶解度以制成高浓度的溶液。
通过结合活性药物与固体赋形剂能制成用于口服的成药，此混合物可碾磨成可接受的程度，也可制成微粒的混合物。如果需要，在加入适宜辅助剂后，可制成片剂和糖衣制剂。特别的是，适宜的赋形剂是某些装填物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或甘梨醇；纤维素成药如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、动物胶、制阿拉伯橡胶的树胶、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚合乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂如交联聚合乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或盐如藻酸盐。
糖衣药丸可包裹适宜的外壳，因此可用浓缩糖溶液，含阿拉伯树胶，滑石，聚合乙烯吡咯烷酮，聚乙烯已二醇，和/或二氧化钛，漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。染料或涂料可被加入片剂或糖衣中用于识别或标示活性化合物剂量的不同组合。
能用于口服的成药包括动物胶制成的配合插入胶囊，动物胶制成的软的密封胶囊和可塑胶如甘油或山梨醇。配合插入胶囊含活性成分，并与填充物如乳糖，黏合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和稳定剂等混合。在软胶囊中，活性药物可溶解或悬浮在适宜液体中，如脂肪油，液体石蜡或液体聚合乙烯乙二醇。另外可加入稳定剂。
可用一些递送的方法，包括a.封装在脂质体中；b.用逆转录载体转导；c.利用在许多细胞核蛋白上找到的细胞核靶点定位到细胞核；d.体内用被转染细胞的再移植或给药进行细胞转染；e.DNA运输系统在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选化合物的方法，所述化合物调控视黄醇X受体RXR和孤儿受体TR3从细胞核迁移到以下部位细胞质、细胞膜、线粒体、高尔基体和/或内质网，其特征在于，包括步骤(a)提供一种细胞，该细胞在细胞核中含有RXR和TR3；(b)在存在或不存在测试化合物情况下培育所述细胞；和(c)选择出调节RXR和TR3从所述细胞的细胞核向以下部位迁移的化合物细胞质、细胞膜、线粒体、高尔基体和/或内质网。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物增加RXR到所述细胞细胞质的迁移。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物减弱RXR到所述细胞细胞质的迁移。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物选自下列物质肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、合成化合物、天然产物、抗体或抗体片段、有机小分子、无机小分子和核酸序列。
5.一种药物组合物，其特征在于，它含有用权利要求1所述方法筛选出的化合物和药学上可接受的载体，而且所述药物组合物通过调控RXR从细胞核向线粒体的亚细胞迁移而影响凋亡。
6.一种筛选化合物的方法，所述化合物调控RXR/TR3 II型异源二聚体的形成，从而影响细胞调亡，该方法包括步骤(a)提供一种细胞，所述细胞含有与线粒体相关的Bcl-2家族蛋白，所述细胞还含有能形成I型和II型RXR/TR3异源二聚体；(b)在存在或不存在测试化合物情况下培育所述细胞；和(c)选出选择性诱导II型异源二聚体形成的化合物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包含选择调控II型异源二聚体从细胞核向线粒体的迁移的化合物。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包含选择调控II型异源二聚体与Bcl-2家族蛋白结合的化合物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，异源二聚体的形成用选自下组的方法鉴别(a)根据所述异源二聚体的构型差别加以鉴别；(b)根据所述异源二聚体的亚细胞定位而被辨认；或(c)对II型异源二聚体特异性的报告基因辨认。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有用权利要求6所述方法筛选出的化合物和药学上可接受的载体，而且所述药物组合物通过调控II型RXR/TR3异源二聚体从细胞核向线粒体的亚细胞迁移而影响凋亡。
全文摘要
本发明公开了一种以视黄醇X受体(RXR)和孤儿受体(TR3)作为药物靶点的筛选药物分子的方法。本发明还公开了用这种方法筛选的药物组合物用于治疗癌症、心脑血管病、糖尿病等多种疾病的方法。
文档编号G01N33/574GK1611939SQ20031010829
公开日2005年5月4日 申请日期2003年10月31日 优先权日2003年10月31日
发明者张晓坤, 曾锦章, 杨汀 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 永春县永春老醋有限责任公司
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