专利名称：海洋水产动物及人类病原菌－创伤弧菌基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及海洋水生经济动物和人类病原菌的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
背景技术：
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种广布于世界各地的靠�：拥�、海湾和海岸线区域以及海产品中的嗜盐菌。此菌是一种条件致病菌，在一定条件下可暴发流行。近年来，随着养殖环境的日益恶化，我国沿海地区因创伤弧菌引起海产品发病或大面积死亡以及人类食物中毒的报道日益增多。目前已知创伤弧菌可感染澳大利亚的尖吻鲈、欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、罗非鱼、中国对虾、鳗鲡、石斑鱼、牡蛎和皱纹盘鲍等多类水产品；另外该菌可通过受污染的海产品和皮肤破损等外伤感染人类，引发人类急性败血症，在1-3天内即可致人死亡。因此，可以说创伤弧菌是海洋水生经济动物弧菌病主要病原菌，也是弧菌属众多弧菌中对人类健康安全�：ψ畲蟮囊恢�。创伤弧菌病具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此目前对创伤弧菌病还未有特效的治疗方法，推行海洋水产品的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对弧菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化鉴定法、免疫学方法(主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法(ELISA))、免疫电镜技术、分子生物学方法(主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态(RELP))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大水产养殖业主和医生掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。
早期快速诊断海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌是目前海洋经济动物养殖的主要措施和减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用创伤弧菌基因保守序列设计的一对引物，建立创伤弧菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于海洋水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也可用于人类急性败血症的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
本发明的海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的基因诊断试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，1管，内装1×PBS，pH7.4；2).PCR反应液B液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE；3).阳性对照液C液，1管，内装创伤弧菌的总DNA，作为阳性模板；4).盒子；5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的基因诊断试剂盒中所述的一对引物VvF和VvR是根据创伤弧菌基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下VvF5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’；VvR5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’用本发明上述试剂盒检测海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的方法，按下列步骤进行1).取新鲜待检样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；待检样品可以是直接取自待检动物的任何部位组织，最好是消化道或肌肉组织；对于人，可取粪便或伤口脓液作为待检样品。
2).6000～8000r/min离心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min离心10min，上清作PCR模板；5).分别取模板和C液，加入到PCR反应液B液中，混匀后离心数秒(通常为500～1000r/min离心5～10sec)，置于PCR仪上；6).按下列条件扩增95℃ 3min预变性→94℃ 1min 34个循环→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察，若在402bp处出现明亮的反应条带，则为创伤弧菌阳性；若无反应条带显示，则为阴性。
本发明的有益效果本发明的海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据创伤弧菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。利用该对引物，可以特异性地扩增携带创伤弧菌的待测样品的有关基因片断，所建立的优化的PCR体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此，使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异的地检测感染创伤弧菌的海洋水产动物，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于海洋水产动物各时期养殖过程细菌中的细菌跟踪检测，也可用于人类急性败血症的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
图1是感染创伤弧菌的杂色鲍肝脏组织样品的PCR扩增结果。其中MDNA分子量标准；1创伤弧菌阳性对照；2创伤弧菌阴性对照；3检测样品；具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1创伤弧菌的基因诊断试剂盒该试剂盒由下列部分构成(10样份)1).样品稀释液(A液)，1管，5ml/管，内装1×PBS，pH7.4。
2).PCR反应液(B液)，1管，250μl/管，内装PCR扩增反应液(25μl体系)，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE。
3).阳性对照液(C液)，1管，20μl/管，内装创伤弧菌总DNA，作为阳性模板；4).长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的一对引物的DNA序列如下VvF5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’；VvR5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’PCR扩增反应液体系(25μl体系)如下ddH2O 21μl10×Buffer 1.8μldNTP 0.4μl引物VvF0.3μl引物VvR0.3μlTaqE 0.2μl
实施例2海洋水产动物和人类病原菌-创伤弧菌的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1).用无菌操作方法，取新鲜杂色鲍肝脏组织0.05g，加入样品稀释液(A液)500μl稀释10倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；2).6000r/min离心5min；3).取上清100μl，煮沸15min，立刻放于冰上5min；4).6000r/min离心10min，上清作为PCR模板；5).分别取模板和C液1μl，加入到PCR反应液(B液)中，混匀后，1000r/min离心10sec，置于PCR仪上；6).按下列条件扩增95℃ 3min预变性→94℃ 1min 34个循环→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察，若在402bp处出现一明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为创伤弧菌阳性，说明检测样品中携带创伤弧菌；若无反应条带显示，则为阴性，表明检测样品中不含创伤弧菌(见图1)。
权利要求
1.海洋水产动物及人类病原菌-创伤弧菌的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，1管，内装1×PBS，pH7.4；2).PCR反应液B液，1管，内装PCR扩增反应液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE；VvF为5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’，VvR为5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’；3).阳性对照液C液，1管，内装创伤弧菌的总DNA；4).盒子；5).一块泡沫板，其大小与盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测海洋水产动物及人类病原菌-创伤弧菌的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1).取新鲜待检样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于无菌匀浆器中冰浴匀浆；2).6000～8000r/min离心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min离心10min，上清作PCR模板；5).分别取模板和C液，加入到PCR反应液B液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；6).按下列条件扩增95℃ 3min预变性→94℃ 1min 34个循环→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反应结束后取5～10μl加2μl溴酚蓝混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察，若在402bp处出现明亮的反应条带，则为创伤弧菌阳性；若无反应条带显示则为阴性。
全文摘要
本发明提供一种海洋水产动物(如鳗鲡、石斑鱼，鲍和对虾等)及人类病原菌—创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以创伤弧菌基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对海洋水产动物(如鳗鲡、石斑鱼，鲍和对虾等)及人类的病原菌—创伤弧菌的特异性DNA片断进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于海洋水产动物各时期养殖过程中的细菌跟踪检测，也可用于人类败血症和软组织感染的临床检测，还可以用于环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。
文档编号G01N21/31GK1560604SQ20041001546
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月26日 优先权日2004年2月26日
发明者邓先余, 何建国, 王智学, 黄志坚, 翁少萍 申请人:中山大学, 珠海福德隆生物技术有限公司
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