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专利名称：果糖赖氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及果糖赖氨酸，即由葡萄糖和氨基酸反应形成的Amadori产物的制备方法。
背景技术：
血液中的糖化白蛋白反应了一段时期内生物体内的血糖水平，近年来被用作糖尿病诊断和治疗的重要指标。目前市场上主要采用酶法用于检测人体内糖化白蛋白的含量，利用该法测定糖化白蛋白需用到一类特殊的酶类——果糖赖氨酸氧化酶，该酶作用于糖化多肽或糖化氨基酸，其作用产物经过一系列氧化还原反应，最后通过终产物的显色来确定糖化白蛋白的含量。因此果糖赖氨酸氧化酶为糖化白蛋白测定中的关键酶。目前研究表明，人血液中糖化白蛋白糖基化的位点为赖氨酸ε-ΝΗ2残基，因此制备人血液糖化白蛋白的模拟底物，即果糖赖氨酸[Νε_( 1-脱氧-D-果糖-Ι-yl)-赖氨酸]，对筛选高活性、高稳定性及高特异性的果糖赖氨酸氧化酶及研究其酶学性质格外重要。该
底物的实质即是氨基酸与还原糖通过美拉德(Maillard)反应生成的中间产物-Amadori
化合物。其反应原理是还原糖的羰基 与氨基酸的氨基之间进行加成，加成物迅速失去I分子水转变为希夫(Schiff)碱,再经环化形成相应的N-取代的醒,最后通过Amadori重排形成较稳定的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。具体的反应过程如下:
权利要求
1.一种果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:包括以下制备步骤: (1)以f10重量份的赖氨酸0-順2衍生物、1(Γ100重量份的D-葡萄糖为原料，8(Γ800重量份醇溶液为溶剂，放入反应容器中，设定反应温度为4(T90°C进行回流反应； (2)反应经l 10h后,停止加热,冷却； (3)将冷却后的反应液控制真空度为-0.0Γ-0.09MPa、温度为3(T50°C进行减压蒸干，得到干物质，在所得的干物质中加入2(Γ150重量份纯水，待溶解后得溶液； (4)将步骤(3)的溶液以0.r5mL/min的流速泵入到强酸性阳离子交换树脂层析柱中，完毕后，先用纯水以f 8mL/min流速洗脱，当所得洗脱液与葡萄糖检测试剂反应不显色时，开始改用0.0f 3mol/L、pH3飞的吡啶甲酸盐或吡啶乙酸盐洗脱，当所得洗脱液与底物检测试剂反应显色时，开始收集洗脱液，直至所得洗脱液与底物检测试剂反应不显色或颜色极浅为止； (5)将步骤(4)收集的洗脱液进行冷冻干燥，得到固体物质并将其溶于f2mol/L盐酸溶液中，室温放置过夜； (6)将步骤(5)放置过夜的试液冷冻干燥，得到固体物质并以1:0.5 10重量比溶于甲醇或乙醚中，在(T10°C下放置，析出白色固形物，过滤，经冷冻干燥后所得的白色固体物质即为果糖赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的赖氨酸α-ΝΗ2衍生物为Na-苄氧羰基-L-赖氨酸,N a -叔丁氧羰基-L-赖氨酸,N a -芴甲氧羰基-L-赖氨酸，Na -马尿酰基-L-赖氨酸，Na -甲酰基-L-赖氨酸，Na -甲酰基-L-赖氨酸中的一种。
3.根据权利要求1所 述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的醇溶液为无水甲醇溶液或无水乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的葡萄糖检测试剂的配方:缓冲液0.0flmol/L，pH5 8.5，葡萄糖氧化酶f 16KU/L，过氧化氢的显色系统；过氧化氢的显色系统包括:过氧化物酶0.5 10KU/L,色原0.2 10mmol/L和成色剂0.2 10mmol/L。
5.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的底物检测试剂的配方:缓冲液2(T200mmOl/L，pH5 8.5果糖赖氨酸氧化酶0.3 10KU/L，过氧化氢的显色系统，过氧化氢的显色系统包括:过氧化物酶0.5 10KU/L,色原0.2 10mmol/L和成色剂0.2 10mmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。
7.根据权利要求6所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
8.根据权利要求4或5所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐中的一种。
9.根据权利要求4或5所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的成色剂为4-氨基安替比林，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物中的一种。
10.根据权利要求1所述的果糖赖氨酸的制备方法，其特征在于:所述的吡啶乙酸盐为4-吡啶乙酸盐、2-吡啶乙酸盐或3-吡啶乙酸盐； 所述的吡啶甲酸盐为4-吡啶甲酸盐、2-吡啶甲酸盐或3-吡啶甲酸盐。
全文摘要
本发明公开一种果糖赖氨酸的制备方法，步骤包括1~10份的赖氨酸α-NH2衍生物、10~100份的D-葡萄糖、80~800份醇溶液回流反应，温度40~90℃、时间1~10h；减压蒸干加20~150份纯水溶解；以0.1~5mL/min的流速泵入到强酸性阳离子交换树脂层析柱中，用纯水以1~8mL/min洗脱，用0.01~3mol/LpH3~6的吡啶甲酸盐或吡啶乙酸盐洗脱，收集洗脱液进行冷冻干燥，得到白色固体物质将其溶于1~2mol/L盐酸溶液中放置过夜，试液冷冻干燥，得白色固形物溶于甲醇或乙醚，0~10℃下放置析出白色固形物，过滤，冷冻干燥得白色固体物质即为果糖赖氨酸。本发明具有制备得率高且得到的底物纯度高的优点。
文档编号G01N21/78GK103113428SQ20131004701
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者邹炳德, 邹继华, 陆慧贤, 周海滨 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司