专利名称：电致化学发光分析的制作方法
技术领域：
本发明的目的是提供一类用于测定电致化学发光现象的方法、利用所说方法来测定分析对象的方法、适用于该方法中的试剂溶液以及适用于实施该方法的专用装置。
若干年前已经公知一些用于测定电致化学发光现象的方法。这类方法是通过氧化作用使某些特定的金属配合物达到一种激发态，然后使其从激发态回复到基态，同时放出电磁辐射。这类方法和适用的金属配合物例如在WO86/02734中有报导。
这种技术已不断地获得改进。在WO90/05296中，将一种胺，优选为三丙胺(它在被氧化时是一种强还原剂)，加入测试组合物中。在一种电解液中产生电化学反应，在该电解液中，电致化学发光(ECL)部分(即金属配合物)能够发射电磁辐射，同时胺被氧化。该说明书描述了一种pH6～9，优选pH7～7.5的磷酸盐缓冲剂，它是一种适用于水溶液的电解质。
为了提高电磁辐射，WO90/05302提出了将一种洗涤剂Triton X-100或Triton N-401加入所说的测试组合物中。WO90/05411描述了一种用于测定ECL的改进仪器。
另外，已经可以应用这样一种用于测定分析对象的技术，这种技术是将一类电致化学发光的标记物偶合到分析对象、分析对象类似物或分析对象-特异物中。该电致化学发光技术可用来定量地测定所存在的分析对象。该说明书详细地描述了一种免疫分析法，该方法是用一种电致化学发光标记物来代替常规使用的标记物。
这种技术的另一些改进和应用描述在WO87/06706、WO89/04392、WO89/10552、WO89/10551、WO90/05301和WO90/11511中。这些出版物的公开内容都被假定为是已知的。
因此，本发明的一个目的是改进所说的已知方法，特别是要结合电致化学发光分析方法来提高检测分析对象时的灵敏度。
本发明的第二个目的是提供一种用于测定在溶液中或在与该溶液接触的固相中的电化学现象的测定方法，所说的溶液是选自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一种洗涤剂。
本发明的第三个目的是一种使用所说方法来测定分析对象的方法以及适用于实施该方法的试剂。
本发明的第四个目的是在上述先有技术的基础上提出一种指导。在这些先有技术文件中较详细地描述了一些主要的电致化学发光方法。用于测定电致化学发光现象的设备包含一个测量单元，该测量单元包括用于装盛试剂溶液的容器、至少两个电极(一个工作电极和一个反电极)，这两个电极在测量时与试剂溶液接触，以及一个用于测定在电致化学发光过程中发出的光的检测器。通常，首先将初始电压(预极化)施加于该溶液中。然后通过在该溶液中含有的一种物质(例如胺)的氧化还原电位来提高该电压。所说被氧化的物质激发了例如某些钌配合物等物质，这些钌配合物能够产生化学发光现象，从而发出光。在一个给定的时间间隔内被检测器接受的光量是对电致化学发光物质存在数量的一种量度。只要将电致化学发光物质作为分析对象、分析对象的类似物或分析对象-特异物(例如在免疫分析中)的一种标记物，那么被接受的光就是分析对象存在量的一种量度。
实验表明，通常与洗涤剂Tween20结合使用的洗涤剂TritonX-100(由WO90/05302已知)不能产生最佳效果。一方面，Triton X-100难以降解，因此对环境不利。另一方面，实验还出乎意料地表明，与Triton X-100相比，某些其他洗涤剂能改善ECL方法。这些特种洗涤剂可用来提高信号输出，提高信号/噪声比例，从而使检测达到更高的灵敏度以及降低检测的低限检测阈值并最后达到更好的精密度。
适用的洗涤剂是一些选自脂肪醇乙氧基化物的洗涤剂，其中包括，例如已经在实际中应用的Polidocanol〔十二烷基聚(乙二醇醚)n〕、C14-EO9〔聚(乙二醇醚)n〕、Genapol〔异十三烷基聚(乙二醇醚)n〕、C8-EO9〔辛醇聚(乙二醇醚)n〕；Plantaren(烷基聚葡糖苷)和辛基葡糖苷(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)或其混合物。这些洗涤剂的使用浓度范围在0.001～1.0％之间。对于每一种洗涤剂都能容易地定出其最佳浓度。最适合的浓度范围在0.1～0.5％之间。
在这种检测组合物中通常使用浓度为5～10mM的叠氮化钠作为防腐剂。实验表明，这种对环境有害的试剂可以用bioban或oxaban来代替，它们对于环境要比叠氮化物有利得多。
出乎意料，这些稳定剂在ECL方法中还具有另一种有利效果，也就是增强了测量信号。Oxaban和bioban的使用浓度为0.01～1％，优选0.1～0.5％。
本发明用于测定在溶液中或在与溶液接触的固相中的电化学现象的方法可以在高于该溶液的凝固点，但低于40℃的温度下进行。
通过在测量装置上使用方波电压还可以进一步提高灵敏度。这是指将初始电压直接增加(至多0.4秒的时间内)到最终电压值。在激发时，该电压实际上保持恒定。在激发时间之后，该电压直接降低到低于该体系的氧化还原电位的数值。而且，该测定方法还扩大了动力学测量范围，即在免疫分析测定的分析对象的浓度范围也可以测定。如果使用较低的温度，则在测定时最好加入盐。
已经证明，最好是将施加于工作电极(相对于Ag/AgCl)的方波终点电压的最大值限定于被氧化物质的氧化还原电位与2.2V之间。较优选的电压范围在1.2与2.2V之间。最优选的是1.4V。如果所用的电极由铂或金制成，则可应用这些数值。
如果通常使用斜坡电压，例如使用三角接线电压，则终点电压(相对于Ag/AgCl)的最大值应限定为3.0V。
出乎意料，在产生电致化学发光现象之前，向工作电极施加一个在+400与-400mV(相对于Ag/AgCl电极)之间的初始电压也可以增强信号。一个特别优选的电压范围在0mV与+200mV之间。另外，如果所用的电极由铂或金制成，则可应用这些数值。对于电极材料的电位可以很容易地计算出。
另外，将pH值调节到6.5至9.0之间，优选6.5至7.5之间，更优选是调节到pH6.8，也可以使信号增强。最好是使用适合于该范围的pH缓冲剂来达到该pH范围。另外，该溶液也可以含有一种或多种其浓度在0.05mmol/l至0.5mol/l之间的碱金属或碱土金属的卤化物。其中优选氯化钠。
上述那些测定方法本身已明显地改进了已知的分析方法。而且，将这些测定方法结合还可以更明显地提高用于检测分析对象的分析方法的灵敏度和/或动力学测定范围。
当分析对象，例如免疫分析的对象，根据夹层原理(sandwich principle)或竞争性方法可以使其检出灵敏度提高时，则所用的方法或仪器可以进一步简化。例如，可以用一个光电二极管作为检测元件，以简化系统的校准，以便提高单位时间内的测定次数，因为测定时间随信号的增强而减少，或者可以减少样品的体积。
本发明的另一个目的是一种用于测定电化学现象，特别是用于检测分析对象的试剂溶液，该试剂溶液含有一种电化学上可氧化的胺或者一种在被氧化时是强还原剂的胺。该溶液含有选自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一种洗涤剂。另外，该溶液可以含有一种浓度在0.1mmol/l至0.5mol/l之间和/或pH值在6.8至8.0之间的碱金属氯化物。而且，该溶液还可以含有常规使用的添加剂，例如缓冲剂、稳定剂和防腐剂。
该试剂溶液最好用bioban或oxaban来稳定。
一种借助电致化学发光来进行检测的仪器例如在WO90/05302中有很详细的描述。另外，这种仪器可以含有用于冷却测量单元的装置和/或一种温度在0至25℃之间的液体容器，如果该分析方法必须在这样低温度下进行的话。该测量单元可以理解为一个用于在其中测量电致化学发光的小室。液体容器可以是一个贮液器，但也可以是一个进料装置，例如一根用于供入试剂溶液的管子，在测定时该液体容器就安放在测量单元中。
本发明还有一个目的是一种利用电致化学发光标记来检测分析对象的方法，其中应用上述用于测定电致化学发光现象所列方法中的一种方法。
下面的实施例用于进一步解释本发明。实施例1进行了一系列试验来测定本发明所用洗涤剂的效果。为了测定洗涤剂对独立于单个试验参数的信号的产生的影响，即对预测定的被分析物的影响使用涂敷有抗生蛋白链菌素的磁性颗粒(HSAP“热的抗生蛋白链菌素颗粒”)作为测定的分析对象，将一种生物素化(biotinylated)的或钌化(ruthenylated)的抗体与其连接。
将一种在WO90/05302的实施例1中描述的仪器用于测量，该仪器在其测量室(Origen 1.0，由IGEN，Rockville，USA或Magnalyser出品)中还含有一块永久磁铁。该仪器还含有一个光电倍增管、一个恒电位器、一个电化学流通室、液体转移工具以及一个50号管式样品搅拌器。
将下列物质一起置于一个试管中以进行分析HSAP〔将冻干的HSAP溶解于Tris/polydocanal缓冲液(100mM；0.1％)pH9.0中，以获得一种浓度为600μg/ml的工作溶液〕 50μlPBS缓冲液(50mM KH2PO4；100mM NaCl；0.1％BSA；pH7.0) 200μl试剂溶液(对每个测定的试剂200mM KH2PO4缓冲剂；100mM TPA；pH7.5)将该混合液滴入一个测量管中，然后将其转移入测量室。用缓冲液(AB)冲洗HSAP，然后测量在该缓冲液中产生的信号。
所用的抗体以生物素-DDS(生物素基-氨基-3，6-二氧杂辛酰基-氨基羰基-庚酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)进行生物素化。利用DSS(二琥珀酰辛二酸酯)将(Tris)(2，2′-联吡啶基)氯化钌六水合物结合到抗体上。
涂敷抗生蛋白链菌素的磁性颗粒从Deutshe Dynal GmbH，德国(Dynabeads M-280 Streptavidin)购得。
用于测量的缓冲液(AB)的组成如下KH2PO4·2H2O 0.2MKOH 0.076MNaCl 0.05mMTPA(三丙胺) 0.1M洗涤剂浓度如表中所述Oxaban/bioban 0.1/0.3％pH7.5所用的对比物为公知的洗涤剂Tween20和Triton X-100，其浓度皆为0.05％。为了进行对比，把在表1中给出的用该洗涤剂获得的信号输出认定为100％。为了获得另一个测量数据，测量在缓冲液(AB)中的非特异性信号输出，并用其来计算HSAP/AB信号输出的比例。在使用和不使用HSAP二者所获得信号输出之间的比例是对分析灵敏度的一个良好指标。从表1给出的结果可以清楚地看出，本发明的洗涤剂是最适合的洗涤剂。
聚乙二醇单十二醚和C8-EO9在HSAP/AB比例方面显示出最好的效果。除了Tween/Triton X-100以外，各种洗涤剂都对信号输出产生负的影响。
表1作为ECL分析的缓冲剂用的洗涤剂电极BPt3PMT 700V
<p>续表1
所用洗涤剂的名称和缩写符号C8-EO9辛醇聚(乙二醇醚)nC14-EO9 聚(乙二醇醚)nC16-EO9 鲸蜡基聚(乙二醇醚)nDodecyl maltoside 十二烷基-β-D-吡喃葡糖基(1→4)α-D-吡喃葡糖苷Genapol 异十三烷基聚(乙二醇醚)n辛基葡糖苷辛基-β-D-吡喃葡糖苷Plantaren 烷基聚葡糖苷(C14-C16)Ralufon 3-14 正十四烷基-n，n-二甲基-3-氨基-1-丙烷硫酸酯SDS 月桂基硫酸钠
Polidocanol 十二烷基聚(乙二醇醚)nTriton X-100辛基苯酚聚(乙二醇醚)nTween 聚(氧化乙烯基)n-脱水山梨醇-单月桂酸酯实施例2使用参数独立试验(parameter-independent test)(HSAP)来测定测量室温度对信号回收的影响，以及如果在测量室温度为28～35℃的条件下使用斜坡电压，则另外还测定动力学与NaCl浓度的关系。
进行如实施例1所述的实验。其中的缓冲液(AB)被具有下列组成的缓冲液BMG2所取代H3PO40.2MPolidocanol0.1％Oxaban 0.1％三丙胺 0.16MKOH0.12MpH 6.8NaCl 浓度如表中所述所获结果示于表2中。温度的增高和盐浓度的增加都会导致ECL信号的增强，该信号可单独用缓冲液(BMG2)获得和用该缓冲液与HSAP结合来获得。HSAP/AB、HSAP/FC和FC/AB比例都几乎与温度无关，但与盐浓度有关。
表2a)温度/盐与ECL信号的关系<
<p>
b)基于28℃，NaCl为0％的计算，％
BMG2具有样品缓冲液BMG2的对照组FC 具有游离轭合物的对照组(生物素化和钌化的抗体)HSAP热的抗生蛋白链菌素颗粒如果温度降低到20℃以下，则必须加入碱金属氯化物并将该溶液的pH值调节到7.25至7.75之间的优选范围。实施例3T3的检测通过一种用于检测三碘甲腺原氨酸(T3)的免疫分析来比较本发明BMG1的检测组合物与先有技术的检测组合物(BMG0)试剂溶液具有下列成分<
还使用下列添加剂HEPES缓冲液7.0HEPES-Na7.0 0.1M0.06％ANS0.1％牛IgG0.5％Byco50mM NaClPAB-RU 在HEPES缓冲液7.0中通过DDS结合到抗T3的PAB上的(钌化的多克隆体)(Tris)(2，2′-联吡啶基)氯化钌六水合物100ng/ml
PH-BI在HEPES缓冲液7.0中的(T3-多半抗原生物素化物)PH PABK-IgG(DE)BOC-T3-IBi600ng/ml样品 标准a-eT3的浓度a0.24ng/mlb0.88ng/mlc1.90ng/mld3.05ng/mle6.65ng/ml3人的血清2人的血清不添加/添加500mg/dl血红蛋白(Hb)抗生蛋白链菌素涂敷的磁性颗粒在HEPES缓冲液7.0中的Dynabeads M-280抗生蛋白链菌素(DeutscheDynal GmbH，德国)600μg/ml将下列物质混合以进行检出反应PAB-Ru50μlDynabeads M-280 50μl样品 30μlPH-Bi 50μlBMG 0或1 500μl将该混合物在28℃培养16分钟，然后将其转移入已保持在28℃温度下的测量室中。将所说的颗粒根据被测试的混合物用BMG 0或1冲洗，然后进行测量。然后施加三角接线斜面电压。测得的电压为0.565V和PMT720mV。
将结果汇总于表3中。可以看出，在BMG 0中观察到的血红蛋白的干扰在BMG 1中不再出现。这不影响检出下限。
表3
LDL(2s)＝检出下限实施例4HBsAg的检测在一种夹层免疫分析中，使用本发明的检测组合物BMG 1来检测HBsAg。将所获结果与使用BMG 0获得的结果进行对比。BMG 0和1的组成已给出在实施例3中。
使用下列试剂HEPES缓冲液pH7.5HEPES-Na 0.05M牛血清白蛋白 1％Genapol X 080 0.1％牛(R)-IgG 0.1％鼠-IgM 10μg/mlCAM(氯乙酰胺) 0.1％
MIT(甲基异噻唑酮)0.01％(methylisothiazolon)AB-Bi(用生物素-DDS进行生物素化的抗体)MAB＜HBs＞M5A10-IgG-Bi(DDS)按1∶7.5在HEPES缓冲液pH7.5中300 ng/mlTAG 利用DDS抗HBsAg〔F(ab′)片段〕结合到单克隆抗体上的(钌化抗体)MAB＜HBs＞M5A1 0-F(ab′)2-BPRU(Tris)(2，2′-联吡啶基)氯化钌六水合物在HEPES缓冲液pH7.5中 500ng/ml样品标准a-hHBsAg浓度a0 U/mlb 0.22 U/mlc 0.52 U/mld 1.08 U/mle 2.30 U/mlf 4.50 U/mlg10.30 U/mlh22.20 U/ml涂敷抗生蛋白链菌素的颗粒Dynabeads M-280抗生蛋白链菌素在HEPES缓冲液pH7.5中 600μg/ml将下列物质混合以进行检出反应Dynabeads M-280 50μlAB-Bi 50μlTAG 40μl样品50μlHEPES缓冲液pH 7.5 20μlBMG 0 or 1 150μl
将该混合物在28℃下培养16分钟，然后将其转移入已加热到282的测量室中。用BMG 0或1来冲洗颗粒，然后进行测量。
将结果汇总于表4中。BMG1的使用明显地改善了检出下限。与BMG 0相比，其CV也有所降低。对于BMG 1来说，在校准曲线上标准样品h至a的数值的比例是上升的，这就可以改善校准曲线的偏差。
表4<
>LDL检出下限CV 偏差系数实施例5TSH的检测为了与先有技术的检测组合物BMG 0进行对比，将检测组合物BMG 1和没有oxaban的BMG 1用于夹层免疫分析中以检测TSH(甲状腺-兴奋激素)。BMG 0和BMG 1的组成已给出在实施例3中。
用夹层免疫分析法测定了甲状腺-兴奋激素(THS)。使用实施例1中描述的仪器来进行这次分析。
将下列物质混合以进行检出反应培养用缓冲液50μl(内含6.06g/l Tris x HCl；
1g/l氯乙酰胺；0.1g/l甲基异噻唑酮，pH8.0；50g/l牛血清白蛋白；10g/l R-IgG)涂敷抗生蛋白链菌素的磁性颗粒(Dynal，2.8μm)在培养用缓冲液中 600μg/ml40μl用DSS(二丁二酰辛二酸酯)结合到生物素化的TSH上的单克隆抗体(MAB)，在培养用缓冲液中 3.0μg/ml40μlTAG用DSS结合到TSH之上的MAB上的(Tris)(2，2′-联吡啶基)氯化钌六水合物，在培养用缓冲液中 1.2μg/ml40μl样品液体或标准 50μl再悬浮液〔加入试剂溶液(BMG 1)〕100μl将该混合物在室温(21℃)下培养16分钟，然后将其转移入已保持在室温下的测量室中。用试剂溶液BMG 1冲洗固定化的颗粒，并在BMG 1中测量。
使用的样品是标准样品a-e，其中的TSH浓度如下
a0 μU/mlb0.39μU/mlc3.54μU/mld12.4μU/mle44.3μU/ml将所获结果汇总于表5中。与BMG 0相比，BMG 1显示出改进的检出极限。加入防腐剂oxaban后进一步降低检测下限阈值。在两种情况下，偏差系数都有明显的改善(BMG 1±oxaban)。
表5
缩写符号的定义与实施例4中给出的相同。
权利要求
1.用于测定在溶液中或在与该溶液接触的固相上产生的电致化学发光现象的方法，其特征在于，该溶液含有选自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一种洗涤剂。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所说的脂肪醇乙氧基化物是聚乙二醇单十二醚、C14-EO9、Genapol或C8-EO9。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所说的溶液含有一种或多种碱金属或碱土金属的卤化物。
4.根据权利要求1至3的方法，其特征在于，所说溶液的pH范围在6.5至9.0之间。
5.根据权利要求1至4的方法，其特征在于，所说的电致化学发光是通过施加2.2V的最大方波电压或3.0V的最大斜坡电压来达到的。
6.用于测定电化学现象的试剂溶液，其中含有一种在被氧化时为强还原剂，可以被电化学氧化的胺，其特征在于，该溶液含有选自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物的一种洗涤剂。
7.根据权利要求6的试剂溶液，其特征在于，其中所含的洗涤剂的浓度为0.001～1％。
8.根据权利要求6或7的试剂溶液，其特征在于，其中还含有一种浓度为0.05mmol/l至0.5mol/l的碱金属氯化物。
9.根据权利要求6至8的试剂溶液，其特征在于，其pH值在6.5至9.0之间。
10.用于通过电化学发光标记检测分析对象的方法，其特征在于，将权利要求1至5之任一项的方法用于检测电化学发光。
全文摘要
用于测定电致化学发光现象的方法，该方法使用某些洗涤剂，以及如果需要，还使用碱金属氯化物和适用于该目的的试剂。
文档编号G01N33/52GK1125480SQ94192464
公开日1996年6月26日 申请日期1994年4月27日 优先权日1993年5月3日
发明者V·克伦姆, G·米勒, U·努曼, U·吉森, N·霍义尔 申请人:曼海姆泊灵格股份公司
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