专利名称：Rna展示的改良方法
技术领域：
本公开内容涉及RNA展示，且具体涉及允许选择可溶性和细胞表面抗原的RNA展示方法。
背景技术：
可以选择以高特异性和亲和力与几乎任何结构表位结合的抗体且将其常规用作研究工具和FDA批准的治疗剂。因此，治疗用和诊断用单克隆抗体构成全世界数十亿美元的市场。使动物免疫接种以获得抗体的传统方法是缓慢且麻烦的。因此，已开发了使用合成抗体文库用于先体外后体内选择针对所需靶分子的抗体的方法。在一些方法中，抗体或其片段的文库展示在生物的表面上，(例如，噬菌体、病毒、酵母细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞)，并且就所需抗体的表达选择生物。在其他方法中，在无细胞体外系统中表达且选择抗体文库。在称为RNA展示的一个此种系统中，所表达的蛋白质或肽与其编码mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成RNA/蛋白质融合分子。可以就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码mRNA组分来测定蛋白质或肽的特性。目前的体外RNA展示系统尽管善于表达单个抗体可变结构域，但在表达多结构域抗体例如单链抗体(scFv)分子方面无效。这主要是由于目前的体外表达系统的反应条件和通过经由PCR的反复扩增丧失来自文库的全长scFv cDNA的趋势。因此，本领域需要改良的体外展示方法用于选择针对所需靶的scFv抗体。发明概述
本发明通过提供改良的体外RNA展示方法解决了前述问题，以允许从表达文库中可靠表达和选择scFv分子。尽管特别适合于表达和选择scFv分子，但本发明的方法对于所有类别蛋白质的体外展示也是有利的，包括可溶性和细胞表面抗原。因此，本发明具有几个优点，这包括但不限于提供改良的体外RNA展示方法，其执行比先前描述的方法更简单且更不耗时。此外，本发明的方法允许含链内二硫键的蛋白质例如scFv抗体分子增强的功能表达。在一个方面，本发明提供了筛选scFv抗体RNA展示文库的方法，该方法包括步骤 (a)提供嘌呤霉素或其类似物交联的scFv mRNA分子，所述分子包括编码5’ scFv和3’间隔区序列的mRNA，所述分子与单链核酸接头交联，所述接头包括在3’末端上的嘌呤霉素或其类似物和在5’末端上的补骨脂素C6 ;(b)在标记的存在下，在GSSG(氧化谷胱甘肽)/GSH (还原谷胱甘肽)和PDI (蛋白质二硫键异构酶)的存在下和在不存在二硫苏糖醇的情况下， 在使得形成标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子的条件下，体外翻译嘌呤霉素交联的scFv mRNA ； (c)纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子；(d)用至少一种抗原对纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子实施抗原选择；和(e)使用基于亲和力的磁珠回收纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤(g)在抗原选择后使scFv mRNA逆转录，以制备cDNA。在另一个实施方案中，该方法进一步包括步骤(h)扩增cDNA。在一个实施方案中，标记是放射性标记，例如mS甲硫氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，3’间隔区序列包括约0 -约200个氨基酸，例如约16个氨基酸，和/或3’间隔区包括亲和标记。在一个实施方案中，接头从5’到3’包括补骨脂素C6、包括序列UAGCGGAUGC(SEQ ID NO 20)的2’ OMe核糖核苷酸、6个三甘醇或PEG-150部分、2个胞苷残基和嘌呤霉素。在一个实施方案中，scFv mRNA分子通过UVA与DNA接头光交联。在另一个实施方案中，scFv mRNA分子包括选自T7、SP6和T3的5’启动子。在具体实施方案中，scFv mRNA 分子包括烟草花叶病毒5’非翻译区。在一个实施方案中，通过寡脱氧胸苷酸层析纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在另一个实施方案中，使用抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在另外一个实施方案中，通过寡脱氧胸苷酸层析和抗FLAG M2单克隆抗体琼脂糖珠纯化标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。在一个实施方案中，抗原是生物素化肽、蛋白质或半抗原。在另一个实施方案中， 抗原是具有人免疫球蛋白可结晶片段(Fe)或具有鼠免疫球蛋白可结晶片段(Fe)的融合蛋白，或抗原是细胞群体。在具体实施方案中，根据本发明的抗体是抗IL-12抗体、抗血凝素 (抗HA)抗体、鼠抗体或人抗体。在一个实施方案中，在GSSH/GSH的存在下执行嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。在一个实施方案中，该方法不包括mRNA加帽步骤。在另一个实施方案中，该方法不包括在纯化步骤前的体外逆转录步骤。在另外一个实施方案中，在步骤(a)到(g)中的任何一个之前、期间或之后添加RNA酶抑制剂。在一个实施方案中，纯化步骤包括在不存在二硫苏糖醇(DTT)的情况下的mRNA逆转录，以产生cDNA。在特定实施方案中，通过在约pH=8.0 -约pH=10. 0的碱水解洗脱cDNA。可替代地，通过足以使DNA:RNA杂交物(hybrids)变性的热、通过在约pH=3. 0 -约pH=6. 0的酸、 或通过RNA酶H消化洗脱cDNA。在一个实施方案中，通过聚合酶链反应扩增cDNA。在一个实施方案中，聚合酶链反应采用热稳定的DNA聚合酶或选自Platinum HiFi和KOD的DNA聚合酶。在另一个实施方案中，珠选自链霉抗生物素蛋白_iC80、中性抗生物素蛋白 (neutravidin) H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-琼脂糖、和 NA-琼脂糖。本发明的其他特征和优点根据下述详述和权利要求将是显而易见的。附图简述
激7描述了在本发明的一些实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。激描述了在本发明的其他实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。图3描述了文库DNA构建体的一般描述。
图4a描述了显示功能性scFv可以作为mRNA-scFv分子生成的结果。图4b描述了游离scFv分子和mRNA-scFv分子的模型。激5描述了显示在mRNA-scFv分子形式中附着的scFv在功能上等价于游离scFv 分子的结果。激6描述了具有不同3’间隔区长度的3种D2E7 mRNA-scFv构建体。激7描述了显示较短的间隔区长度改善mRNA-scFv与抗原的结合和mRNA-scFv抗体分子得率的结果。激S描述了 D2E7短、中等和长Ck 3’间隔区的序列(SEQ ID NOS 42-44，分别按出现的次序)。S9a描述了具有短和长间隔区长度的17/9 mRNA-scFv构建体。图9b描述了显示较短的间隔区长度改善17/9 mRNA-scFv分子与靶抗原的结合和 mRNA-scFv抗体分子得率的结果。
图10描述了显示PDI活性是一些scFv功能所需的结果。图11描述了显示在逆转录过程中DTT的存在抑制17/9 scFv与血凝素(HA)抗原的结合的结果。图12描述了显示DTT不显著改变逆转录过程的琼脂糖凝胶电泳结果。图13描述了在选择前和后来自具有或不具有DTT和RNaseOUT 的不同RT条件的琼脂糖凝胶电泳结果。激招描述了显示与选择前RT和cDNA的碱洗脱(左泳道)相比较，在选择前或后逆转录时，Phylos 40 VH序列的回收的琼脂糖凝胶电泳结果。图15描述了显示在抗原选择后RNA酶抑制剂保存通过逆转录的RNA模板回收的琼脂糖凝胶电泳结果。厲76描述了在RNaseOUT 的存在或不存在下，CL-长和CL-短间隔区的并排比较结果。 激7 7描述了显示在RNaseOUT 的存在或不存在下，CL-长和CL-短间隔区回收的并排比较的琼脂糖凝胶电泳结果。厲7S描述了在一轮mRNA-scFv选择前和后，定量17/9 scFv的琼脂糖凝胶电泳结^ ο图19描述了在D2E7和2SD4之间的嵌合体的一般描述。激^ 描述了在不同嵌合体之间在抗原结合后的回收百分比，从而显示mRNA展示技术可以用于区别具有不同亲和力的结合剂。激湖力描述了在抗原选择后标准化的回收百分比，从而显示mRNA展示技术可以用于区别具有不同亲和力的结合剂。激描述了 mRNA-scFv分子的热稳定性。图22描述了显示RNA可以在mRNA-scFv分子的高温处理后回收的琼脂糖凝胶电泳结果。激恐描述了具有短和长间隔区长度的mRNA-scFv Y61构建体以及在mRNA和scFv 蛋白质之间的DNA接头上包括聚腺苷酸尾的PF-y61SCGene3构建体。图24描述了在本发明的其他实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。
发明详述
序列标识号
说明书中提及的核苷酸和氨基酸序列已给予下述序列标识号
SEQID NO:]-MAK195 scFv蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO2-Y61 scFv短蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO3-Y61 scFv长蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO4-Y61 scFv Gene3蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO5-D2E7 scFv短蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO6-D2E7 scFv中等蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO7-D2E7 scFv长蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO8-17/9 scFv短蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO9-17/9 scFv长蛋白质序列的氨基酸序列。
SEQIDNO10-MAK195 scFv核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO11-Y61 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO12-Y61 scFv长核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO13-Y61 scFv Gene3PA核苷酸序列的核酸序列
SEQIDNO14-Y61 scFv Gene3核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO15-D2E7 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO16-D2E7 scFv中等核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO17-D2E7 scFv长核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO18-17/9 scFv短核苷酸序列的核酸序列。
SEQIDNO19-17/9 scFv长核苷酸序列的核酸序列。为了本发明可以更容易理解，首先定义了特定术语。I.定义
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、人抗体、鼠抗体及其片段，例如抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F (ab，)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、和单结构域抗体片段(dAb)。术语“抗体文库”指包含可读框(ORF)的多个DNA或RNA分子，所述可读框编码抗体或其片段。它还包括由所述DNA或RNA分子表达的多个抗体蛋白质和核酸/抗体融合分子。术语“重链可变结构域”指编码抗体重链可变区的核酸和所述核酸的蛋白质产物。术语“轻链可变结构域”指编码抗体轻链可变区的核酸和所述核酸的蛋白质产物。术语“附加表位”指由抗体特异性识别的短氨基酸序列，其与分子化学或遗传地附着，以允许所述分子通过所述抗体的检测，例如FLAG标记、HA标记、Myc标记或T7标记。术语“非抗体序列”指在本发明的抗体文库中出现的任何核酸或氨基酸序列，其不是原始抗体序列的部分。此种序列包括例如附加表位。术语“控制序列”指在具体宿主生物或体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列或遗传元件。此种序列是本领域众所周知的。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、 多腺苷酸化信号和增强子。例如，当核酸置于与另一种核酸序列的功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，如果它影响序列的转录的话，或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，如果它如此放置，以便促进翻译的话。 一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是邻接的。然而，增强子无需是邻接的。术语“特异性结合”或“与之特异地结合”指结合分子以至少1 χ 10_6 MU χ ΙΟ"7 MU χ IO"8 MU χ IO"9 MU χ 1(Γ10 Μ、1 χ 1(Γ" Μ、1 χ 1(Γ12 M 或更少的亲和力与靶结合， 和/或以是其对于非特异性抗原的亲和力至少2倍的亲和力与靶结合的能力。术语“靶”指由抗体识别的抗原或表位。靶包括任何肽、蛋白质、糖、核酸或其他分子，包括对于其可以生成特异性抗体的小分子。在一个实施方案中，抗体针对人蛋白质，例如 TNF α、IL-12、IL18、IL-1 α 或 IL-1 β。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。 具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中得到限定。术语“RNA展示”或“mRNA展示”指体外技术，其中所表达的蛋白质或肽与其编码 mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成“RNA/蛋白质融合”分子。可以就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码 mRNA组分来测定蛋白质或肽的特性。此种方法是本领域众所周知的，并且例如在美国专利号 7，195，880 ；6，951，725 ；7，078，197 ；7，022，479，6，518，018 ；7，125，669 ；6，846，655 ； 6，281，344 ；6，207，446 ；6，214，553 ；6，258，558 ；6，261，804 ；6，429，300 ；6，489，116 ； 6，436，665 ；6，537，749 ；6，602，685 ；6，623，926 ；6，416，950 ；6，660，473 ；6，312，927 ； 5，922，545 ；和6，348，315中描述；所述专利各自整体引入本文作为参考。术语“单链抗体”或“scFv”指使用重组方法通过使得其能够制备为单条蛋白质链的合成接头连接的轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，其中VL 和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird (1988) Science 242:423-426 40^^^0/7^(1988)/^0^. Natl. Acad. Sci. K 5 J 85:5879-5883)。术语“功能部分”指对其与之附着的分子赋予另外功能性的任何生物或化学实体。术语“选择”指使分子与群体中的其他分子基本上分开。如本文使用的，“选择”步骤提供在选择步骤后相对于群体中不希望有的分子，所需分子至少2倍、优选30倍、更优选 100倍、且最优选1000倍富集。如本文指出的，选择步骤可以重复任何次数，并且不同类型的选择步骤可以在给定方法中组合。术语“中止序列(pause sequence)，，指促使核糖体减慢或停止其翻译速率的核酸序列。术语“固体支持体”指但不限于亲和复合物可以与之直接或间接(例如通过其他结合配偶体中间物，例如其他抗体或A蛋白)结合，或亲和复合物可以包埋入其中(例如，通过受体或通道)的任何柱(或柱材料)、珠、试管、微量滴定皿、固体颗粒(例如，琼脂糖或琼脂糖凝胶(s印harose))、微芯片(例如，硅、硅-玻璃或金芯片)、或膜(例如，脂质体或小泡的膜)。术语“接头区域”指使scFv抗体基因中编码抗体VH和VL结构域的核酸序列连接的核酸区域。接头区域与编码抗体VH和VL的核酸序列符合读框，从而使得形成包含VH、 VL和接头区域的邻接可读框。该术语还指在scFv蛋白质中连接VH和VL的区域。
术语“肽接纳体”指通过核糖体肽基转移酶功能的催化活性能够添加到成长中的蛋白质链的C末端的任何分子。一般地，此种分子包含(i)核苷酸或核苷酸样部分(例如， 嘌呤霉素及其类似物)，(ii)氨基酸或氨基酸样部分(例如，20种D-或L-氨基酸中的任何一种或其任何氨基酸类似物(例如，由Ellman等人，Meth. Enzymol. 202:301，1991描述的 0-甲基酪氨酸或任何类似物)，和(iii》个之间的键(例如在3’位置上或较不优选地在2’ 位置上的酯、酰胺或酮键)；优选地，这种键不显著干扰来自天然核糖核苷酸构象的环结构。 此外，这个术语包括但不限于与蛋白质编码序列共价键合(直接或通过间插核酸序列间接) 的肽接纳体分子，以及通过一些非共价方法与蛋白质编码序列连接的那种，例如通过使用第二种核酸序列的杂交，所述第二种核酸序列在蛋白质编码序列的3’末端上或接近3’末端处结合，并且其自身与肽接纳体分子结合。II.概沭
本发明的特征在于体外RNA展示的改良方法，其允许从表达文库中可靠表达和选择 scFv抗体分子。RNA展示方法一般涉及蛋白质或肽文库的表达，其中所表达的蛋白质或肽与其编码mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成RNA/蛋白质融合分子。可以就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码mRNA 组分来测定蛋白质或肽的特性。目前的RNA展示方法不是对于scFv抗体表达最佳的，这是因为几个步骤在还原条件下进行，这阻止scFv链内二硫键的形成且从而阻止scFv抗体分子的正确折叠。目前方法另外在选择过程中利用VH或VL抗体片段。本发明通过在温和还原条件下执行体外RNA展示测定，解决了这个技术问题，所述温和还原条件有利于scFv链内二硫键且从而有利于scFv抗体分子的正确折叠。使用 scFv形式而不是单个可变结构域(例如，单个可变重(VH)结构域)还消除了对于所选择的 VH结构域转化为完全IgG抗体所需的鉴定相容的可变轻(VL)结构域的需要。因此，尽管特别适合于表达和选择scFv抗体分子，但本发明的方法对于所有类别蛋白质的体外RNA展示也是有利的。本发明的方法还提供了用于执行RNA展示的更短和更简单的规程。这部分通过避免在用靶选择前使RNA-蛋白质融合物中的mRNA逆转录为cDNA的费时步骤来达到。III. 改良的体外RNA展示筛选方法
在一个方面，本发明的特征在于改良的体外RNA展示筛选方法。一般方法如下 1)RNA/蛋白质融合物的形成
使一种或多种体外抗体DNA表达文库转录，以生成mRNA。任何体外抗体表达文库都是合适的(例如，VH、VL或scFv文库)，然而，本发明的方法特别良好地适合于scFv文库。任何领域公认的转录方法都是合适的。在RNA转录后，去除DNA文库模板。这可以使用任何领域公认的方法完成，例如通过用DNA酶I消化。在DNA去除后，使肽接纳体与文库mRNA的3’末端附着。这可以使用任何领域公认的方法完成。在一个实施方案中，使用包括5’ (补骨脂素C6)2’0Me (U AGC GGA UGOXXX XXX CC (嘌呤霉素)3’ (SEQ ID NO :20)的接头(其中X是三甘醇或PEG-150，并且CC是标准DNA主链)。首先通过互补碱基配对允许接头与文库mRNA的3’末端结合。随后通过补骨脂素C6分子的UV活化使接头与mRNA交联。
在肽接纳体添加后，随后在体外系统中翻译文库mRNA。任何领域公认的体外翻译方法都是合适的，例如兔网织红细胞裂解物。然而，为了允许在scFv分子中的正确链内二硫键形成，将蛋白质二硫键异构酶(PDI)添加到体外翻译反应中，和/或在温和氧化条件下执行反应。在一个实施方案中，将温和氧化剂(例如GSSG/GSH，例如IOOmM GSSG /IOmM GSH) 添加到体外翻译反应中。在另一个实施方案中，还原剂(例如，二硫苏糖醇(DTT))从体外翻译反应中省略。一种或多种标记的氨基酸或其衍生物可以添加到体外翻译系统中，从而使得标记的氨基酸掺入所得到的抗体内。预期任何领域公认的标记的氨基酸，例如放射性标记的氨基酸，例如mS标记的甲硫氨酸或半胱氨酸。在体外翻译反应过程中，mRNA分子经由在3’末端上融合的肽接纳体(例如，嘌呤霉素)与其蛋白质产物共价连接。从体外翻译反应混合物中纯化掉这些RNA/蛋白质融合分子。预期了任何领域公认的从反应混合物中分离RNA/蛋白质融合分子的方法。在一个实施方案中，使用聚脱氧胸苷(polydeoxythimidine) (Poly dT)树脂通过层析分离RNA/蛋白质融合蛋白。在另一个实施方案中，通过与对于RNA/蛋白质融合蛋白的抗体组分中存在的表位特异的抗体结合，分离RNA-抗体融合蛋白。表位可以是掺入RNA-抗体融合蛋白的抗体组分的氨基酸序列内的氨基酸序列标记，例如FLAG或HA标记，例如在N末端、C末端上或在可变区间接头中。本发明的RNA/蛋白质融合物涉及裸RNA的使用。在优选实施方案中，接触RNA/ 蛋白质融合物的所有试剂用RNA酶抑制剂试剂进行处理，例如RNaseOUT 、酵母tRNA、 SUPERaseIn , RNasin 和本领域已知的其他RNA酶抑制剂。2)针对所需靶筛选抗体
就与所需靶的体外结合筛选RNA/蛋白质融合物的文库。一般而言，靶分子与固体支持体例如琼脂糖珠结合。在一个实施方案中，靶分子与固体基质直接连接。在另一个实施方案中，靶分子首先进行修饰，例如生物素化，随后使修饰的靶分子经由修饰与固体基质结合，例如链霉抗生物素蛋白H\G80、中性抗生物素蛋白H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、 NA-MyOne、SA-琼脂糖、和NA-琼脂糖。在其他实施方案中，固体支持体进一步包括磁珠，例如Dynabeads。此种磁珠允许使用磁体从测定混合物中分离固体支持体和任何结合的RNA/ 抗体融合物。在RNA/蛋白质融合物结合后，使固体支持体洗涤一次或多次，以去除未结合的 RNA/蛋白质融合物，并且随后扩增RNA。在一个实施方案中，使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA扩增，以产生更多mRNA。预期了任何领域公认的RNA复制方法，例如使用RNA 复制酶。在另一个实施方案中，在通过PCR扩增前，可以使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA转录成cDNA。可以对PCR扩增的库实施一轮或多轮筛�。愿患罡咔缀土固�。另外或可替代地，在扩增核酸组分前，可以从固体支持体中洗脱RNA/蛋白质融合物。预期了任何领域公认的洗脱方法。在一个实施方案中，使用碱性条件例如使用约8.0 -10. 0的pH，洗脱RNA/蛋白质融合物。在另一个实施方案中，使用酸性条件例如使用约3. 0 -6.0的pH，洗脱RNA/蛋白质融合物。在一个实施方案中，在扩增核酸组分前，不洗脱RNA/ 蛋白质融合物，而是将RNA/蛋白质融合物直接添加到扩增反应混合物中。另外或可替代地，核酸的PCR扩增库可以使用单个分子测序方法进行测序，以测
10定每一种选择的RNA/蛋白质分子的核酸序列。在一个实施方案中，PCR扩增可以使用高保真度的校正聚合酶完成，例如来自Thermococcms kodakaraensis的KODl热稳定性DNA聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen)0另外或可替代地，核酸序列可以在导致突变引入扩增的DNA的条件下扩增，从而将进一步的多样性引入所选择的核酸序列内。可以对这种DNA分子突变库实施进一步的筛选循环。IV.文库构建
本发明的文库可以由能够与靶结合的任何抗体片段生成。在一个实施方案中，生成抗体可变结构域的文库。这些可以是VH和/或VL结构域。在另一个实施方案中，生成scFv 文库。本发明的文库还可以包括编码在可变区外的区域的抗体核酸序列，例如其恒定区或片段，或铰链区。本发明的核酸文库可以包括RNA、DNA或包含RNA和DNA元件的杂交物。核酸与肽接纳体的连接
抗体核酸文库可以进行修饰以包含肽接纳体部分。这可以促进核酸表达文库的个别成员与其关连蛋白质产物的共价附着。预期了任何领域公认的肽接纳体与核酸附着的方法， 包括例如在美国专利号5，643，768、美国专利号5，658，754、美国专利号7，195，880和美国专利号6，951，725中描述的方法，所述专利的内容引入本文作为参考。在一个方面，本发明的特征在于用于使肽接纳体与核酸文库附着的新方法和组合物。在一个实施方案中，可以合成包括补骨脂素C6分子和肽接纳体分子的连接分子，其中补骨脂素C6分子和肽接纳体分子与核酸序列融合，其中所述核酸序列与核酸文库的3’末端上的序列互补。此种连接分子可以经由互补碱基配对与核酸文库克隆的3’末端结合。 补骨脂素C6对紫外(UV)线敏感，并且将使接头与核酸文库克隆交联，从而使肽接纳体与核酸文库克隆共价连接。在另一个实施方案中，接头分子的核酸部分可以包含修饰的核苷酸， 例如2’甲氧基(2’ OMe)核糖核苷酸。在另一个实施方案中，接头分子进一步包括使包含补骨脂素C6分子和肽接纳体分子的核酸区域分离的三甘醇或PEG-150接头。在一个实施方案中，接头从5’到3’可以包括补骨脂素C6、包括序列UAGCGGAUGC (SEQ ID NO 20)的 2’ OMe)核糖核苷酸、6个三甘醇或PEG-150部分、2个胞苷残基和嘌呤霉素。此种接头可以通过例如 TriLink BioTechnologies, Inc 定制合成。V. 一般筛选方法
在一个方面，本发明的特征在于筛选本发明的表达文库的方法，以鉴定能够与所需靶结合的抗体。预期了基于抗体与靶分子的结合，允许从表达文库中选择抗体的任何体外或体内筛选方法。在一个实施方案中，本发明的表达文库可以使用领域公认的体外无细胞表型-基因型连接的展示进行筛选。此种方法是本领域众所周知的，并且例如在美国专利号 7，195，880 ；6，951，725 ；7，078，197 ；7，022，479,6, 518，018 ；7，125，669 ；6，846，655 ； 6，281，344 ；6，207，446 ；6，214，553 ；6，258，558 ；6，261，804 ；6，429，300 ；6，489，116 ； 6，436，665 ；6，537，749 ；6，602，685 ；6，623，926 ；6，416，950 ；6，660，473 ；6，312，927 ； 5, 922, 545 ；和6，348，315中描述。这些方法涉及以这样的方式从核酸体外转录蛋白质，从而使得蛋白质与它源于其的核酸在物理上缔合或结合。通过用靶分子选择表达的蛋白质， 同样选择编码蛋白质的核酸。为了改善SCFv蛋白质的表达，上文提及的体外筛选测定可能需要特定试剂的添加或去除。在一个实施方案中，蛋白质二硫键异构酶可以添加到体外表达系统中，以改善功能scFv分子的生产。在另一个实施方案中，温和氧化剂(例如GSSG/GSH，例如IOOmM GSSG /IOmM GSH)可以添加到scFv蛋白质的体外翻译反应混合物中，以允许scFv分子的VH和VL 区中的链内二硫键形成。在另一个实施方案中，还原剂(例如，二硫苏糖醇(DTT ))可从scFv 的体外翻译反应混合物中去除。在另一个实施方案中，一种或多种标记的氨基酸或其衍生物可以添加到体外翻译系统中，从而使得标记的氨基酸掺入所得到的抗体内。预期了任何领域公认的标记的氨基酸，例如放射性标记的氨基酸，例如35S标记的甲硫氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，本发明的体外筛选测定需要在抗体或多种抗体的体外选择后，可以使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA逆转录，以生成编码所述抗体或多种抗体的cDNA。预期了用于逆转录的任何合适方法，例如酶介导的逆转录，例如莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶。在本发明中采用的筛选方法可能需要扩增编码与所需靶特异性结合的抗体的核酸。在一个实施方案中，可以使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA扩增，以产生更多 mRNA。预期了任何领域公认的RNA复制方法，例如使用RNA复制酶。在另一个实施方案中， 在通过PCR扩增前，可以首先使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA逆转录成cDNA。在一个实施方案中，PCR扩增可以使用高保真度的校正聚合酶完成，例如来自Thermoco⑶us AotZa^araefl1Si1S 的 KODl 热稳定性 DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen)0在另一个实施方案中，PCR扩增可以在将突变引入扩增的DNA内的条件下执行，例如易错PCR。在另一个实施方案中，本发明的表达文库可以通过在细胞、病毒或噬菌体表面上展示，并且实施使用固定化靶分子的选择进行筛选。合适的筛选方法在美国专利号 7，063，943 ；6，699，658 ；6，423，538 ；6，696，251 ；6，300，065 ；6，399，763 ；6，114，147 和 5，866，344 中描述。在本发明中采用的筛选方法可能需要通过引入核酸置换和/或缺失将多样性引入抗体文库内，这可以导致在表达的抗体分子中的一个或多个氨基酸置换和/或缺失。预期了任何领域公认的诱变方法，例如随机诱变、“步移(walk through)"诱变和“审核(look through)”诱变。可以使用例如易错PCR、酵母或细菌的“增变”株、或在所有或部分抗体的从头开始合成过程中随机或限定的核酸改变的掺入来达到抗体的此种诱变。在一个实施方案中，可以生成抗体分子的文库，其中一个或多个氨基酸是随机突变的。在另一个实施方案中，可以生成抗体分子的文库，其中一个或多个氨基酸突变为一个或多个预定的氨基酸。在本发明中采用的筛选方法还可能需要增加靶-结合筛选测定的严格性，以选择对于靶具有改善的亲和力的抗体。可以考虑增加抗体-靶相互作用测定的严格性的任何领域公认的方法。在一个实施方案中，可以改变一种或多种测定条件(例如，测定缓冲液的盐浓度)，以减少抗体分子对于所需靶的亲和力。在另一个实施方案中，可以减少允许抗体与所需靶结合的时间长度。在另一个实施方案中，竞争结合步骤可以添加到抗体-靶相互作用测定中。例如，可以首先允许抗体与所需固定化靶结合。随后可以添加特定浓度的非固定化靶，其用来与固定化靶竞争结合，从而使得从固定化靶中洗脱对于抗原具有最低亲和力的抗体，从而导致具有改善的抗原结合亲和力的抗体富集。通过增加添加到测定中的非固定化靶的浓度，可以进一步增加测定条件的严格性。本发明的筛选方法还可能需要多轮选择，以富集具有改善的靶结合的一种或多种抗体。在一个实施方案中，在每轮选择时，进一步的氨基酸突变可以使用领域公认的方法引入抗体内。在另一个实施方案中，在每轮选择时，可以增加与所需靶结合的严格性，以选择对于所需靶具有增加的亲和力的抗体。本发明的筛选方法可能需要从体外翻译系统的组分中纯化RNA-抗体融合蛋白。 这可以使用任何领域公认的分离方法完成。在一个实施方案中，使用聚脱氧胸苷(poly dT) 树脂通过层析分离RNA-抗体融合蛋白。在另一个实施方案中，通过层析使用对于RNA-抗体融合蛋白的抗体组分中存在的表位特异的抗体，可以分离RNA-抗体融合蛋白。表位可以是掺入RNA-抗体融合蛋白的抗体组分的氨基酸序列内的氨基酸序列标记，例如FLAG、Myc 或HA标记，例如在N末端、C末端上或在可变区间接头中。从本发明的文库中选择抗体可能需要使用固定化的靶分子。在一个实施方案中， 靶分子与固体基质例如琼脂糖珠直接连接。在另一个实施方案中，靶分子首先进行修饰， 例如生物素化，随后使修饰的靶分子经由修饰与固体支持体结合，例如链霉抗生物素蛋白 H\C80、中性抗生物素蛋白 H\C80、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne, NA-MyOne, SA-琼脂糖、 和NA-琼脂糖。本发明的例证(EXEMPLIFACTION)
实施例自始至终，使用下述材料和方法，除非另有说明。材料与方法
一般而言，除非另有说明，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是例如免疫球蛋白技术)和畜牧业的常规技术。参见例如，Sambrook，Fritsch和 Maniatis,Molecular Cloning :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology),510, Paul, S. , Humana Pr (1996) ；Antibody Engineering :A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. , Irl Pr (1996) ；Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow ^A, C. S. H. L. Press, Pub. (1999) ;Current Protocols in Molecular Biology,编辑 Ausubel 等人，John Wiley & Sons (1992)。用于scFv的mRNA展示规程
mRNA展示可以根据图2中所示的方法进行。这种方法的具体实施方案在下文更详细地描述。这些实施方案预期举例说明本发明的方法，并且不应解释为限制性的。1.抗体文库模板的设计
根据本领域已知的抗体文库生成方法可以设计文库DNA构建体。在一个实施方案中， 文库构建体可以编码抗体片段，即抗体轻链片段(VL)或抗体重链片段(VH)。在一个示例性实施方案中，文库构建体可以编码单链可变片段(scFv)。2.革巴抗原的制备
一般地，mRNA展示抗体文库可以针对生物素化抗原进行选择。虽然关于每种靶的最佳抗原应基于具体情况(case-by-case)进行测定，但下述考虑可以用作一般指导。靶抗原一般是充分表征的，并且是相关或显性遗传同种型，如通过多态性(SNP和单元型)和/或药物遗传学分析测定的。靶抗原另外可以具有合理生物活性(可与天然抗原比较)、良好可溶性以及良好的化学和物理性质，并且可以以足够量制备以用于文库选择或筛选和下游生物测定。3.文库DNA的制备
文库DNA及其选择输出可以通过PCR进行扩增。PCR扩增可以使用本领域已知的方法执行。PCR反应一般包含DNA模板、反应缓冲液、dNTP、用于扩增的引物、DNA聚合酶和水。 多个反应管可以由主混合物同时设立，以增加扩增的DNA得率。25个PCR循环一般给出足够扩增，但多达35个循环可以用于获得更多产物。4.文库DNA纯化
如果产物是正确大小(对于scFv 850 bp，对于VH或VL文库 500 bp)且包含最低限度非特异性产物，那么产物可以直接用于转录反应中。可替代地，通过切出正确大小的特异性条带，可以在制备型琼脂糖凝胶上纯化产物。DNA浓度可以在分光光度计上进行测量。5. RNA 转录
来自文库DNA的RNA转录可以使用本领域已知的标准方法执行。大反应体积可以用于转录足够的DNA模板，以取样整个文库多样性。在示例性实施方案中，1 χ IO13文库模板拷贝可以用于RNA转录反应中。RNA转录一般包含5-10 μδ PCR产物、反应缓冲液、ATP、CTP、 GTP、UTP和T7 RNA聚合酶。RNA转录反应可以在37°C运行2小时至过夜。在初始选择循环后可以使用较短的时间，然而，过夜温育可以使反应的RNA得率达到最大。在RNA转录后， DNA模板可以通过DNA酶I消化从反应混合物中去除。6.通过NAP柱层析的RNA纯化
在转录后，RNA可以使用NAP-10柱进行分级分离。最高达约1 mL转录反应可以装载到NAP-10柱上用于RNA纯化。在分级分离前，柱可以使用DEPC处理的dH20进行平衡。RNA 可以使用约1. 5X反应体积DEPC处理的dH20 (例如750 μ L/500 μ L转录反应)从柱中洗脱。总洗脱体积可以小于约150%的转录反应体积。RNA可以另外或可替代地使用ΝΑΡ-25 柱进行分级分离。7. RNA质量控制和定量
RNA样品的大小和得率可以使用凝胶电泳，或可替代地通过测量收集的级分中RNA浓度在沈0 nm下的OD (OD26tl)进行分析。例如，scFv RNA的摩尔浓度可以如下计算 [RNA] (μ M)= [RNA] (mg/mL) X IO6 / (850 X 330) =OD260 X 稀释因子 X 40 (Pg/mL) X 1000 / (850 X 330)。RNA 得率(nmol)= [RNA] ( μ Μ) X 体积(μ L)/ 1000
RNA得率一般达到每500 μ L转录反应约20 nmol/mL的最大限度。8. RNA与接头的连接
在其3’末端上包含肽接纳体分子的DNA接头可以通过UV交联与每种RNA分子的3’ 末端共价连接。可以进入核糖体A位点且与新生多肽链的羧基末端共价偶联的肽接纳体， 可以最终使得mRNA (基因型)能够与由这种RNA编码的蛋白质(表型)共价结合。可以使用具有下式的示例性PEG6/10接头5'(补骨脂素 C6) 2，OMe (U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (嘌呤霉素)3，(SEQ ID NO:
20)
补骨脂素C6 5'修饰是光敏感的，并且作用于通过UV交联在接头和mRNA之间产生共价键。2，OMe (U AGC GGA UGC) (SEQ ID NO :20)主链区域与 mRNA 上的 FLAG 序列 3，的接头退火位点退火(参见图1)。在上文序列中，X指示“间隔区9”，可替代地称为三甘醇或 PEG-150。这个间隔区已得到最优化，以提供用于嘌呤霉素插入真核核糖体A位点内的柔性。CC包括标准DNA主链。嘌呤霉素3'修饰插入核糖体A位点内，以在接头和新生肽之间产生稳定连接。关于本文描述的接头的消光系数可以是约147.7 0D26(l/ymOle。因为这种接头是光敏感的，所以包含这种接头的溶液应被保护不受光。对于文库选择的初始循环，可以推荐大规模连接反应(约5 nmol或约3. 1 X IO15 转录的RNA分子)，以取样具有约IO12 - IO13的估计多样性的首次用于实验的抗体文库的整个多样性。这种RNA量可以确保足够模板掺入翻译反应内，以产生 10 pmol功能mRNA展示分子。在随后循环中，RNA输入可以减少至约0.5 nmol/选择。在示例性实施方案中，RNA 连接反应可以包含下述组分RNA、水、化学连接缓冲液和PEG6/嘌呤霉素接头(ImM)。在示例性实施方案中，总反应体积是约100 UL0在优选实施方案中，接头/RNA摩尔比可以大于约1. 5。在一个实施方案中，反应中的最终接头浓度是约15 μ M，并且反应中的RNA浓度范围可以为约3 - 10 μ M (= 0.3 - 1 nmol RNA输入)。作为参考，1 mg/mL的850 nt scFv RNA= 3.56 μ M和可达到的最大限度连接浓度将是约3. 16 μ M (约0. 32 nmol)。退火反应(这使接头与转录的RNA退火)可以在热循环仪中执行。在优选实施方案中，通过在约85°C温育样品约30秒，随后在约4°C，可以执行退火反应，其中使用约0.3°C/ 秒的斜升速率。反应随后可以在约4°C保持。退火的接头/RNA的连接可以通过UV交联完成。这可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。在一个实施方案中，反应管可以置于冷冻制冷器包之上，并且直接置于手提式长波长(约365 nm) UV灯下，并且在黑暗中交联约15分钟。一般连接效率是约50 -90%。一般不需要纯化。连接产物可以贮存于_80°C。9.翻译反应
在示例性实施方案中，在所有反应和纯化后，约输入RNA可以制备成mRNA展示分子。体外翻译使用本领域技术人员已知的方法和试剂进行。在一个实施方案中，使用scFv 文库的翻译反应使用在约15 mL的反应体积中的约5 nmol RNA模板连同约10 mL网织红细胞裂解物。在用于翻译反应的制备中，GSSG/GSH (氧化谷胱甘肽/还原谷胱甘肽)溶液可以以约100 mM GSSG/10 mM GSH的终浓度制备。通过使PDI粉末溶解于dH20内制备PDI，以达到约1单位/ μ L的浓度。PDI溶液可以贮存于_20°C。示例性翻译反应可以如下设立翻译反应可以在30°C水浴中温育1 - 2小时，并且RNA/蛋白质融合物形成应无延迟地执行。当翻译体积超过3 mL时，可以观察到RNA/蛋白质融合物得率中的显著降低；因此， 如果反应体积大于3 mL，那么可以制备翻译反应的主混合物，并且随后分成小等分试样。10. RNA/蛋白质融合物形成
在翻译反应后，对于每300- μ L翻译反应混合物，可以添加约100 μ L 2Μ KCl和约20 μ L IM MgCl2，并且在室温温育约1小时，或在-20°C过夜。可替代地，对于每1.5 ml翻译反应混合物，可以添加约500 μ L 2M KCl和约100 μ L IM MgCl2，并且在室温温育约1小时，或在_20°C过夜。这使在mRNA模板末端上的中止的核糖体稳定，并且允许在DNA接头的末端上的嘌呤霉素进入中止的核糖体的A位点，这使翻译的scFv蛋白质与其mRNA模板永久连接。如果反应在-20°C贮存过夜，那么室温温育可以缩短。反应可以通过分别添加约 50 μ L或约250 μ L 0. 5 M EDTA / 300 μ L或1. 5 ml翻译反应以破坏核糖体得到终止。 反应可以贮存于-20°C。可以取出5-10 μ L等分试样用于随后闪烁计数。11. 通过寡脱氧胸苷酸纤维素的RNA/蛋白质融合物纯化
包括这个步骤，以从翻译/融合反应中纯化mRNA展示分子和剩余的RNA模板。对于寡脱氧胸苷酸结合，应估计捕获所有RNA模板所需的预洗涤的寡脱氧胸苷酸纤维素量。足够体积的寡脱氧胸苷酸结合缓冲液可以添加到融合反应，以达到约IX终浓度。随后可以添加预洗涤的寡脱氧胸苷酸纤维素，并且使反应在4°C旋转1小时。反应可以任选在4°C以约 1500 rpm离心5分钟，并且弃去上清液。可以转移寡脱氧胸苷酸纤维素珠，并且使用旋转柱，用IX寡脱氧胸苷酸结合缓冲液洗涤约6次，并且缓冲液一般通过使柱以约1000 rpm旋转10秒去除。可以弃去流通物(flow-through)，但可以保存末次洗涤用于闪烁计数。为了减少盐浓度且促成洗脱，dH20初始浆体积的1/10可以添加到干燥寡脱氧胸苷酸珠中，这可以立即离心10秒且可以弃去流通物。通过将dH20添加到珠中且在室温温育5分钟，可以洗脱mRNA展示分子(和游离RNA模板)。通过以约4000 rpm (或更高)旋转20秒收集洗脱物。洗脱一般重复1次，且组合洗脱物。可以取出5 μ L洗脱物用于闪烁计数。任选地，还可以通过在NanoDrop分光光度计机器上在沈0 nm的OD (OD26tl)评估寡脱氧胸苷酸纯化的效率。所有剩余的RNA模板和mRNA展示分子在理论上通过寡脱氧胸苷酸珠回收。5X FLAG 结合缓冲液添加到洗脱物中，以达到约IX终浓度。样品可以贮存于-80°C，如果未进行至下一个FLAG纯化步骤的话。
寡脱氧胸苷酸回收可以如下计算。约5μ L输入(来自融合反应)、来自末次洗涤的约100 yL、和约5 μ L输出(来自寡脱氧胸苷酸纯化的洗脱物)。末次洗涤用于评估洗涤程度，并且其他2个计数用于计算来自原始RNA模板输入的RNA/蛋白质融合物回收。RNA/蛋白质融合物得率(pmol)= (CPM输出X体积输出X 5 μΜ X体积裂解物)/ [CPM输人X体积 Λ X (产物中的甲硫氨酸#)]。这个公式假定网织红细胞裂解物中的5-μ M甲硫氨酸浓度，并且计算中使用的所有体积表示为yL。对于较早的选择循环，mRNA展示分子的得率一般是0.5 - 2%，但在随后循环中可以增加至10%。例如，PROfusion文库中甲硫氨酸的早期循环数目可以是
对于 VH-V κ scFv 约 3 μ M
对于 VH-V λ scFv 约 2 - 3 μ Μ,
对于VH约2 μ Μ,
对于Vk约2 μ Μ，和
对于V λ约1 μ Μ。这些数目是平均值并且基于种系序列，并且本领域技术人员将认识到当文库针对特异性序列富集时，它们可以随着选择循环改变。12. 通过抗FLAG Μ2琼脂糖的RNA/蛋白质融合物纯化
这个步骤设计为从剩余的RNA模板中纯化mRNA展示分子。如果文库将通过抗原解离速率(off-rate)竞争或通过抗原表达细胞进行选择，那么无需进行至这个步骤。可以估计捕获所有mRNA展示分子所需的预洗涤的抗FLAG M2琼脂糖珠的量。在一个实施方案中，珠的结合容量可以是约6 nmol融合蛋白/mL 50%浆。为了具有足够的珠体积用于在结合和洗涤过程中处理，推荐使用至少约200 μ L预洗涤的珠。下文给出的例子用于初始300-μ L 翻译反应。FLAG纯化宽口移液管管尖可以用于将300 μ L预洗涤的抗FLAG M2琼脂糖转移至寡脱氧胸苷酸纯化的输出，这随后可以在4°C旋转1小时。与抗FLAG M2琼脂糖温育可以继续过夜。抗FLAG M2琼脂糖可以任选在4°C在离心机中以约1500 rpm旋转约1分钟，并且可以弃去上清液。抗FLAG珠可以用约500-700 μ L IX FLAG结合缓冲液洗涤约5_6次， 其中使用旋转柱(例如hvitrogen Microcentrifuge Spin Column)，并且对于每次洗涤以约1000 rpm离心10秒(应当指出Invitrogen 柱可以以更高速度例如约10,000 rpm旋转)。可以弃去流通物。通过以约1000 rpm离心10秒，珠可以另外用700 μ L选择缓冲液 (参见下文)洗涤2次。可以保存末次洗涤用于闪烁计数。通过添加约400 μ L 100 yg/mL FLAG肽(在选择缓冲液中)且在室温温育5分钟，可以洗脱mRNA展示分子。洗脱物(elute) 可以通过以约3000 rpm (或可能时更高)旋转20秒进行收集。通过添加约400 μ L 100 Ug/mL FLAG肽，洗脱步骤可以再复一次。2种洗脱物可以组合，并且可以取出约5 yL用于闪烁计数。这个体积的FLAG肽可以足以洗脱最达约1 mL 50%浆，并且如果使用较少的浆和/或需要更高的RNA/蛋白质融合物浓度，那么可以减半(cut in half) (200 μ L)。 为了预防在贮存和抗原选择过程中的RNA降解，合适量的本领域已知的RNA酶抑制剂(即， 1 - 2 U/μ L RNaseOUT和0. 02 μ g/mL酵母tRNA)可以添加到纯化的mRNA展示文库中。 如果不进行至下一个抗原选择步骤，那么将样品贮存于-80°C。为了定量FLAG回收，在β计数器上计数约5 μ 洗脱输出和来自末次洗涤的约100 μ 。可以预期10-30%或更高的回收，并且可以根据下式进行计算 PROfusion分子回收％ = (CPM输出X体积输出)/ (CPMfix X体积输入) 13. 通过生物素化抗原的文库选择
设计选择以在与抗原的文库结合达到平衡时，富集与目的靶特异性结合的分子。可能需要阴性选择(预澄清)，以从首次用于实验的scFv文库中去除非特异性和基质结合剂，但如果使用由单个模板制备的文库，例如但不限于基于单个scFv模板进行亲和力成熟的制备用于亲和力成熟的文库，那么可以省略。依赖于靶形式，选择规程改变。下述是用于与生物素化靶一起使用的示例性选择规程。这种规程可以进行修饰，以适应以其他形式的靶抗原，并且依赖于所需输出可以按比例扩大或缩小。Α.在选择前的制备
链霉抗生物素蛋白(SA)磁珠可以用于捕获，并且一般在使用前预封闭。SA珠可以从原始瓶转移到1. 5或2 mL管，并且用2 mL IX FLAG结合缓冲液洗涤2次。珠可以用2 mL选择缓冲液(2小时到过夜)在4°C伴随旋转进行封闭。重要的是制备足够珠用于两者，预澄清和选择捕获。预封闭的珠可以贮存于4°C。约100 PL珠一般用于每10 pmol生物素化抗原，但本领域技术人员将认识到捕获珠体积应考虑到相对于反应得率的游离生物素结合容量进行计算(例如650-900 pmoles/mg珠，其中珠浓度一般是10 mg/ml)。1.5 mL或2 mL微量离心管(microfuge tube)可以用IX FLAG结合缓冲液预封闭约1小时到过夜。预封闭的管可以用于所有预澄清和选择步骤。一般地需要4个管用于每个样品2个用于预澄清，1个用于珠，并且1个用于选择。最佳结果可以通过使文库预澄清获得。FLAG纯化的mRNA展示文库可以添加到珠 (与缓冲液分离)，其中使用等于捕获体积一半的SA珠体积。珠可以在30°C旋转约30分钟。 预澄清的mRNA展示文库可以使用磁体与珠分离，并且预澄清可以再重复一次。第二种预澄清的SA珠可以如上文所述洗涤且计数，以测定本底是否高。这还可以充当‘无抗原’阴性对照。B.文库选择结合
对于第一轮选择，生物素化靶(100 nM)可以添加到整个预澄清的文库，并且在30°C旋转1小时。对于随后的选择循环，当抗原结合分子的回收预期超过时，预澄清的文库可以分成2个相等等分试样。生物素化抗原可以添加到一个等分试样，并且另一个可以充当 ‘无抗原’阴性对照。可替代地，洗涤的第二种预澄清珠也可以被视为‘无抗原’对照，如上所述，尽管这些珠将具有一次较少的‘预澄清’。当抗原结合分子的回收超过5%时，随后循环中的抗原浓度可能降低。特别地，如果抗原看起来‘粘性’且在早期循环中观察到显著回收，那么抗原浓度应减少。当抗原结合分子的回收变得显著高于本底时(例如相对于无抗原对照)，抗原浓度在随后循环中可以减少。重要的是注意文库和抗原之间的化学计量，以确保存在超过文库PROfusion分子的至少5倍摩尔过量的抗原，尤其是在较低抗原浓度。C.文库选择捕获
用于封闭SA珠用于文库捕获的选择缓冲液可以通过离心和磁性分离去除。抗原结合的文库可以转移至预封闭的SA珠(与缓冲液分离)，并且随后至结合反应，并且在30°C旋转 5 - 10分钟。用于捕获的SA珠的量应基于容量和选择中使用的靶浓度进行计算(参见上文)。当降低靶浓度以避免SA珠结合剂时，SA珠的量应降低，但一般使用不小于50 yL的珠。D.文库选择洗涤
SA珠可以使用磁体进行收集，并且用约1 mL选择缓冲液洗涤1分钟。这个步骤可以重复约5次(总共约6次)。洗涤时间可以在随后循环中增加，以对一些靶掺入解离速率选择策略。珠可以用适合于逆转录的约1 mL IX缓冲液洗涤最后一次，用磁体收集，并且在水中重悬浮(上文计算的捕获珠体积的四分之一)。作为另一个例子，可以使用Dynabeads TManvitrogen)，但本领域技术人员将认识到其他珠可以是同样合适的。Dynabeads 可以通过离心和磁性分离与未结合的文库分离。 上清液可以用1 mL管尖取出，其中使用一个新过滤的管尖用于每个文库选择管，以消除交叉污染。Dynabeads 可以用1 mL选择缓冲液洗涤，并且通过轻轻移液或通过使管颠倒多次重悬浮。在处理下一个文库时，管可以放回到磁支架上用于珠分离。在洗涤所有文库后， 上清液可以通过1 mL管尖取出，其中使用一个新过滤的管尖用于每个文库选择管，以消除交叉污染。对于5次洗涤重复。Dynabeads 可以用1 mL IX第一链缓冲液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗涤2次。在末次洗涤时，如果需要如此，那么取出文库的1/10 至分开管用于计数，以测定文库回收。Dynabeads 可以通过磁性分离捕获，并且可以保存约 100 μ 1洗涤缓冲液用于本底计数。Dynabeads 可以重悬浮于水中，其中使用如上计算的 %捕获珠体积)。Ε.文库选择计数和回收计算
从第3轮开始，计数约10 - 20%的末次洗涤和珠。计数超过100 PL珠是不可取的， 因为这可以猝灭计数。文库选择回收可以根据下式进行计算 选择回收％ = 100 X CPM总珠/ CPM总输入
14.通过Fc融合蛋白平衡文库选择
在另一个实施方案中，文库选择可以对于已与抗体Fc结构域融合的靶抗原(例如，Fc 融合蛋白)执行。可能需要阴性选择(预澄清)，以从首次用于实验的抗体文库中去除非特异性和基质结合剂，但对于亲和力成熟可以省略。选择特异性可以通过使靶抗原与人IgGl和小鼠IgGh融合得到改善。通过在文库选择过程中在Fc融合蛋白中具有不同Fc结构域， 可以使鉴定对Fc区特异性的文库结合剂的危险降到最低。这还将使得文库结合剂能够通过2种不同磁珠(G蛋白和抗小鼠IgG)拉下(pulled down)，从而进一步减少回收抗G蛋白或抗抗小鼠IgG结合剂的概率。靶Fc融合蛋白也可以是生物素化的，并且通过本文描述的方法或通过上文章节13中描述的方法进行选择。应当指出A蛋白磁珠可能不适合于针对 Fc融合蛋白靶选择，这是因为与抗体VH结构域的特定部分的交叉反应性(例如源于人VH3 家族种系序列的VH)。用于拉下抗原结合scFv-PROfusion分子的合适磁珠包括但不限于， Dynabeads G蛋白、Dynabeads Pan小鼠IgG、和针对人或小鼠IgGs的其他可用的Dynabeads M-280o 一般而言，G蛋白珠容量被视为约25 PgAlgGl Γ167 pmol )/100 yLA/G蛋白磁珠。A.在选择前的制备
Dynabeads G蛋白或Dynabeads Pan小鼠IgG (如果靶抗原是小鼠Fc融合蛋白)可以用于捕获，并且一般在使用前预封闭。可以计算对于文库预澄清和选择所需的Dynabeads 量。Dynabeads可以从原始瓶转移到1.5或2 mL微量离心管，并且去除缓冲液。珠可以用1 mL选择缓冲液(2小时到过夜)在4°C或在室温1小时进行封闭。重要的是制备足够珠用于预澄清和选择捕获。1. 5 mL或2 mL微量离心管可以用选择缓冲液预封闭1小时到过夜，并且预封闭的
管应用于所有预澄清和文库选择步骤。FLAG纯化的scFv PROfusion文库可以添加到预封闭的珠(与缓冲液分离)，可使用等于捕获体积⑶卩上计算)一半的Dynabead (G蛋白或Pan小鼠IgG)体积，并且反应在30°C 旋转30分钟。预澄清的融合物文库可以使用磁体与珠分离，并且预澄清再重复一次。第二种预澄清的Dynabeads可以如上文所述洗涤且计数，以测定本底是否高。这还可以充当‘无抗原’阴性对照。B.文库选择结合
对于第一轮选择，生物素化靶(100 nM)可以添加到整个预澄清的文库，并且在30°C旋转1小时。对于随后的选择循环，当抗原结合分子的回收预期超过时，预澄清的文库可以分成2个等分试样(依赖于文库计数，从50/50到80/20)。生物素化抗原可以添加到一个等分试样(整体的50 - 80%)，而另一个等分试样可以充当‘无抗原’阴性对照。可替代地，洗涤的第二种预澄清珠也可以被视为‘无抗原’对照，如上所述，只是它将具有一次较少的‘预澄清’。如果抗原看起来‘粘性’且在早期循环中观察到显著回收，那么抗原浓度可以减少。此外，当抗原结合分子的回收变得显著高于本底时(无抗原对照)，抗原浓度在随后循环中可以减少。重要的是注意文库和抗原之间的化学计量，以确保存在超过文库PROfusion 分子的至少5倍摩尔过量的抗原，尤其是在较低抗原浓度下。C.文库选择捕获
用于封闭Dynabeads用于文库捕获的选择缓冲液可以通过离心和磁性分离去除。抗原结合的文库可以转移至预封闭的Dynabeads (与缓冲液分离)，并且随后至结合反应，并且在 30°C旋转20分钟。用于捕获的Dynabeads的量应如上所述基于珠容量和选择中使用的靶抗原浓度进行计算。为了避免拉下珠粘合剂，当靶抗原浓度减少时，Dynabeads的量应减少 (但不小于500 yg或50 μ L)0D.文库选择洗涤
Dynabeads 可以通过离心和磁性分离与未结合的文库分离。上清液可以用1 mL管尖取出，并且一个新过滤的管尖可以用于每个文库选择管，以消除交叉污染。新移液管管尖可以用于由约1 mL选择缓冲液洗涤Dynabeads 并且Dynabeads 可以通过轻轻移液或通过使管颠倒多次进行重悬浮。在处理下一个文库时，管可以放回到磁支架上用于珠分离。在洗涤所有文库后，上清液可以通过1 mL管尖取出(使用一个新过滤的管尖用于每个文库选择管，以消除交叉污染)。对于5次洗涤可以重复这个步骤。Dynabeads 可以用1 mL IX第一链缓冲液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗涤2次。在末次洗涤时，如果需要如此，那么取出文库的1/10至分开管用于计数，以测定文库回收。Dynabeads 可以通过磁性分离捕获，并且可以保存约100 μ 1洗涤缓冲液用于本底计数。Dynabeads 可以重悬浮于水中，其中使用如上计算的％捕获珠体积)。Ε.文库选择计数
可以如上文章节13 (E)中所述执行。15.通过抗原竞争的解离速率文库选择解离速率选择和平衡选择之间的主要差异是在FLAG纯化前，文库首先与选择抗原结合。在FLAG纯化后，文库可以与过量竞争抗原或抗体(例如当竞争者抗原不可用时)温育， 从而使得在解离速率竞争过程中变得与PROfusion分子不结合的任何预结合的抗原由竞争者替换。竞争者不同于预结合的抗原之处在于，竞争者结合的PROfusion分子不可以在后续回收步骤中回收。它们可以是未修饰的抗原或不同形式的抗原。尽管抗体也可以是竞争者，但一般地它们不是与抗原一样有效的竞争者，并且它们的效率随着文库对于抗原的亲和力增加而降低。恰好在选择前测定文库的解离速率是有利的，以鉴定竞争的适当持续时间。这种持续时间可以范围从几小时到几周。A 具有生物素化抗原或抗原-Fc融合蛋白的预装载文库
PROfusion分子可以如上所述进行翻译且通过寡脱氧胸苷酸进行纯化。寡脱氧胸苷酸纯化的文库可以通过添加5X FLAG结合缓冲液至IX的终浓度(仅仅添加25%的文库体积) 进行平衡。可以添加抗原(生物素化或Fc-融合物)至足够高浓度，并且在30°C旋转30分钟，以饱和抗原-抗体结合。PROfusion分子可以通过抗FLAG M2琼脂糖如上所述进行纯化。重要的是应当指出FLAG纯化的PROfusion文库应保持在冰上，但不冷冻。重要的是如上所述预封闭足够量的捕获珠。B 测定竞争者浓度和文库基线回收
可以计算来自上述步骤的回收的文库的量，以测定其摩尔浓度。这代表文库结合的抗原的最大限度量，并且可以用于计算对于解离速率竞争所需的量(500X至1000X)。10%预封闭的珠可以添加到来自抗原结合的PROfusion文库的10%等分试样，并且在约4°C旋转约20分钟。珠可以如上所述用1 mL选择缓冲液洗涤5次。珠可以如下进行计数，以测定在解离速率选择前通过抗原结合的PROfusion文库百分比
回收％ = 100 X (CPM珠 / CPM输入)X 10 C:文库选择竞争
1000倍摩尔过量的竞争者(例如未修饰的抗原或抗体)可以添加到FLAG纯化的 PROfusion文库，并且在约30°C旋转预定持续时间，这将施加足够的选择压力，以选择具有更佳解离速率的克隆。使文库在冰上冷却约1 - 2分钟，以减慢珠捕获前的解离速率。D 文库选择捕获
用于封闭Dynabeads用于文库捕获的选择缓冲液可以通过离心和磁性分离去除。抗原结合的文库可以转移至预封闭的Dynabeads (与缓冲液分离)，并且在4°C旋转约20分钟。E 文库选择洗涤
Dynabeads可以通过离心和磁性分离从文库中收集。上清液可以用1 mL管尖取出(使用一个新过滤的管尖用于每个文库选择管，以消除交叉污染，如上所述)。珠可以用约1 mL IX第一链缓冲液(Superscript II，Invitrogen)如上所述洗涤 2次。在末次洗涤时，如果需要如此，那么取出文库的10 - 20%至分开管用于计数，以测定文库回收。Dynabeads可以通过磁性分离捕获，并且可以保存100 μ 1洗涤缓冲液用于本底计数。珠可以重悬浮于水中(如上计算的1/4捕获珠体积)。F 文库选择计数和回收计算
可以计数10 - 20%的末次洗涤和珠。避免使用超过100 μ L珠是可取的，因为这可以猝灭计数。文库选择回收可以使用下式进行计算选择回收％ = 100 X CPM总珠/ CPM总输入 16.文库选择输出的逆转录
逆转录可以用 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen )完成。每禾中反应的体积可以根据在选择后的珠体积按比例扩大。输出可以通过用合适引物对逆转录(RT) 进行分析。例如，‘Ck反向，或‘Ck5-FLAGA20 Rev’引物可以用于κ文库，‘CJL反向，或 ‘CL5FLAGA20 Rev，引物可以用于 λ 文库，并且 ‘Lib_GS_Rev，或 ‘VH_GSFLAGA20-Rev，引物可以用于人PBMC VH文库。逆转录引物应具有至少与后续PCR反向引物相同的5’末端序列，以避免从逆转录反应留下残留引物，从而产生具有不同3’末端序列的扩增产物。如果较短‘Ck反向’、‘CJL 反向’或‘Lib-GS-Rev’引物用于RT，那么这是尤其重要的，因为任何残留量的这些引物可以参与下述PCR，并且产生缺乏聚腺苷酸尾的产物。表1 用于扩增文库选择输出的寡核苷酸引物
示例性RT反应条件
对于200 μ L最终体积的反应，RT反应可以如下设立
权利要求
1.一种筛选scFv抗体RNA展示文库的方法，所述方法包括步骤(a)提供嘌呤霉素或其类似物交联的单链Fv(scFv) mRNA分子，所述分子包括编码5’ scFv和3’间隔区序列的mRNA，所述分子与单链核酸接头交联，所述接头包括在3’末端上的嘌呤霉素或其类似物和在5’末端上的补骨脂素C6 ；(b)在标记的存在下，在使得形成标记的嘌呤霉素交联的scFvmRNA/蛋白质分子的条件下，体外翻译所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA ；(c)纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFvmRNA/蛋白质分子；(d)用至少一种抗原对所述纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFvmRNA/蛋白质分子实施抗原选择；和(e)使用基于亲和力的磁珠回收所述纯化的标记的嘌呤霉素交联的scFvmRNA/蛋白质分子。
2.权利要求1的方法，其进一步包括步骤(g)在抗原选择后使所述scFvmRNA逆转录， 以制备cDNA。
3.权利要求2的方法，其进一步包括步骤(h)扩增所述cDNA。
4.利要求1的方法，其中所述标记是放射性标记。
5.利要求4的方法，其中所述标记是35S甲硫氨酸或半胱氨酸。
6.利要求1的方法，其中所述3’间隔区序列包括约0-约200个氨基酸。
7.利要求1的方法，其中所述3’间隔区序列包括约16个氨基酸。
8.利要求1的方法，其中所述3’间隔区序列包括亲和标记。
9.权利要求1的方法，其中所述核酸接头从5’到3’包括 -补骨脂素C6 ；-包括序歹Ij UAGCGGAUGC (SEQ ID NO 20)的 2，OMe 核糖核苷酸； -6个三甘醇或PEG-150部分； -2个脱氧胞苷残基；和 -嘌呤霉素。
10.权利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子通过UVA与所述DNA接头光交联。
11.权利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子包括选自T7、SP6和T3的5’启动子。
12.权利要求1的方法，其中所述scFvmRNA分子包括烟草花叶病毒5’非翻译区。
13.权利要求1的方法，其中通过寡脱氧胸苷酸层析纯化所述标记的嘌呤霉素交联的 scFv mRNA/蛋白质分子。
14.权利要求1的方法，其中使用抗FLAGM2单克隆抗体琼脂糖珠纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。
15.权利要求1的方法，其中通过寡脱氧胸苷酸层析和抗FLAGM2单克隆抗体琼脂糖珠纯化所述标记的嘌呤霉素交联的scFv mRNA/蛋白质分子。
16.权利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白质或半抗原。
17.权利要求1的方法，其中所述抗原是具有人免疫球蛋白可结晶片段(Fe)的融合蛋 白。
18.权利要求1的方法，其中所述抗原是具有鼠免疫球蛋白可结晶片段(Fe)的融合蛋白。
19.权利要求1的方法，其中所述抗原是生物素化肽、蛋白质或半抗原。
20.权利要求1的方法，其中所述抗原是细胞群体。
21.权利要求1的方法，其中所述抗体是抗IL-12抗体。
22.权利要求1的方法，其中所述抗体是抗HA抗体。
23.权利要求1的方法，其中所述抗体是鼠抗体。
24.权利要求1的方法，其中所述抗体是人抗体。
25.权利要求1的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
26.权利要求I-M中任一项的方法，其中另外在GSSH/GSH的存在下执行所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。
27.权利要求沈的方法，其中另外在蛋白质二硫键异构酶(PDI)的存在下执行所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。
28.权利要求I-M中任一项的方法，其中另外在不存在二硫苏糖醇的情况下执行所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。
29.权利要求27的方法，其中另外在不存在二硫苏糖醇的情况下执行所述嘌呤霉素交联的scFv mRNA的体外翻译。
30.权利要求1的方法，其中所述方法不包括mRNA加帽步骤。
31.权利要求1的方法，其中所述方法不包括在所述纯化步骤前的体外逆转录步骤。
32.权利要求1的方法，其中在步骤(a)到(g)中的任何一个之前、期间或之后添加RNA 酶抑制剂。
33.权利要求1的方法，其中所述纯化步骤包括在不存在二硫苏糖醇(DTT)的情况下的所述mRNA逆转录，以产生cDNA。
34.权利要求2或33的方法，其中通过在约pH=8.0 -约pH=10. 0的碱水解洗脱所述 cDNA。
35.权利要求2或33的方法，其中通过热洗脱所述cDNA。
36.权利要求2或33的方法，其中通过在约pH=3.0 -约pH=6. 0的酸洗脱所述cDNA。
37.权利要求33的方法，其中通过聚合酶链反应扩增所述cDNA。
38.权利要求37的方法，其中所述聚合酶链反应采用热稳定的DNA聚合酶。
39.权利要求37的方法，其中所述聚合酶链反应采用选自PlatinumHiFi和KOD的扩增酶。
40.权利要求1的方法，其中所述珠选自链霉抗生物素蛋白_iC80、中性抗生物素蛋白-M280、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-琼脂糖、和 NA-琼脂糖。
全文摘要
本发明的特征在于体外RNA展示的改良方法，以允许从表达文库中可靠表达和选择scFv抗体分子。改良方法部分涉及温和还原条件的使用，这有利于scFv链内二硫键且从而有利于scFv抗体分子的正确折叠。尽管特别适合于表达和选择scFv抗体分子，但本发明的方法对于所有类别蛋白质的体外RNA展示也是有利的。
文档编号G01N33/53GK102227638SQ200980147651
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者C·谢, J·E·梅莫特, Y·A·库茨科瓦 申请人:雅培制药有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
