专利名称：鸦片样受体功能的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选方法，它包括在用于神经病和/或精神病的筛选检查中测试一种LC132受体拮抗剂。更确切地说，该筛选方法基于将LC132受体与推测为LC132受体功能的拮抗剂的药剂接触，接着测试该化合物的结合性和/或拮抗剂活性，然后测试有LC132拮抗剂活性的药剂在抗癫痫、抗惊厥和/或抗焦虑的筛选中的应用情况，以证明其对这些疾病的相应治疗活性。
现在，苯并二氮杂类受体拮抗剂(如阿普唑仑、地西泮、劳拉西泮)仍然是治疗焦虑疾病、尤其是急性焦虑病的主要临床药物。由于苯并二氮杂受体拮抗剂具有抗惊厥性能，所以其中的某些也用作镇癫痫药。最近，业已发现其它药物在治疗焦虑疾病中的临床应用，例如选择性5-羟基胺重摄取抑制剂(如氟西汀)和丁螺环酮。治疗癫痫的主要药物有卡马西平、苯妥英、丙戊酸盐、乙琥胺和苯巴比妥。如下所述，在药理治疗焦虑、癫痫和惊厥方面可得到的药物都不是最佳药物。
焦虑是一种生理现象，它表现为对真实的或潜在的危险的警告信号。当不存在真实的危险或当情绪的强度被夸大时，焦虑就成为病理现象。如果患器官疾病者产生生理和病理焦虑就有可能危及生命，并且会导致或延长各种生理机能障碍。各种焦虑病属于较为常见的精神�。莨兰拼笤�4～8％的人患有这类病。有大量文献记载表明用苯并二氮杂受体拮抗剂治疗焦虑病后，病情会立即缓解。尽管这类药物的功效会维持一段较长的时间，但实施治疗数周以上就会出现一系列问题。虽然对于不同的病人可通过优化苯并二氮杂受体拮抗剂的剂量而大大避免不希望的副作用，但对于严重的焦虑和癫痫病例以及对于减轻病理性肌肉紧张所需的剂量对不眠症的抑制往往会达到如此程度，即扰乱智力机能并降低从事各种技术性工作(操作机器、开汽车)时的注意力和精确性。个人对这种超镇静作用(oversedation)的敏感性大不一样。肌肉松弛会导致言语不清和步法紊乱、尤其是老年病人。在高剂量时、对中枢活性药物体验极少的病人甚至在正常剂量时都可能出现行为的抑制解除。长期接触苯并二氮杂受体拮抗剂也会出现问题，问题之一就是形成对疗效的耐受性。相当一部分病人会丧失抗癫痫效验(表现为脱逸现象(escape phenomena))。物质依赖性表现为突然停止服药后的药物中止症状，它的影响因素有接触药物的持续时间、剂量、药物作用的持续时间、以及病人的个性。重氮螺癸二酮(azaspirodecanedione)丁螺环酮只表现抗焦虑活性，它与通过苯并二氮杂受体拮抗作用起作用(它显示抗惊厥、肌肉松弛、和镇静/催眠效果)的抗焦虑剂形成鲜明的对照。据假设，丁螺环酮的作用机理包括5-羟色胺1A受体的部分拮抗性。与苯并二氮杂受体完全拮抗剂相比，丁螺环酮的优点在于更小的镇静作用、更少的精神运动性损伤连同耗酒精量、物质依赖性更低、和大为减少的滥用倾向。然而，抗焦虑活性起始时的长潜伏期显著不同于典型的苯并二氮杂类安定药，后者迅速起作用。此外，有可能出现丁螺环酮的治疗顺序性问题，有关先用苯并二氮杂受体拮抗剂治疗过的或显示严重焦虑的病人的疗效问题。丁螺环酮不但是对医疗设备的有价值的辅助物(其地位已逐渐变得更为明确)；而且从理论方面来看它也相当重要，因为它是满足强烈的临床功效与当今的安全标准的最重要的抗焦虑药。考虑到选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRIs)的作用机理，这类药物的药理效果似乎归因于突触间隙中导致神经递质5-羟色胺可得性的增加。但是，SSRIs开始时的治疗作用缓慢，一般至少需要几周。尽管SSRIs是早期开发的且优先用作抗抑郁药，但它在治疗恐慌症方面的应用日益增多，例如氟西汀或强迫观念与行为的疾�。绶趁�。人们对SSRIs的耐受性良好，但是，这类药物的副作用有神经质、震颤、头昏、头痛、失眠症、性机能障碍、恶心和腹泻。此外，三环抗抑郁药氯米帕明是一种有效的非选择性5-羟色胺重摄取抑制剂，已被证实可用于治疗强迫观念与行为的疾病[例如参见，Martin and Haefely，in“Principles of Pharmacology，Eds.(Munson)et al.，Chapman & Hall，N.Y.，1995，pp.243-277]。
癫痫是一种神经病，大约有1％的人患有此病。该慢性病的特征在于复发的自发性癫痫发作不是由活性脑疾病引起的。癫痫发作突然，是无意的、受时间限制的交替行为，它与脑神经元的过量冲动释放有关。现在癫痫病一般是根据病人表现的主要癫痫发作类别而分类的(一位给定的病人可能有多种癫痫发作，但其中的一种比其它种更频繁而被用作分类的根据)。按癫痫发作的类别分类的一个实在的优点是，在某种程度上可预测对可选择的疗法的应答性。一般地，只有大约一半的病人利用抗癫痫药而使其癫痫发作受到很好的控制；另一半病人则可分为两类偶然发作癫痫的患者和不能由抗癫痫药物控制癫痫发作和/或因药物而招致不可接受的不利效果的病人。而且，现在常用的药物会引起副作用。癫痫发作的病因较多，而其起因通常不明，所以具有抗惊厥效果的镇癫药与其它药物在治疗上很重要。(例如参见Lloyd and Gillenwater，in“Principles ofPharmacology，Eds. Munson et al.，Chapman & Hall，N. Y.，1995，pp.363-398)。
以前，被称为“orphanin FQ”或“nociceptin”的长度为17个氨基酸的肽(F-G-G-F-T-G-A-R-K-S-A-R-K-L-A-N-Q)已被从大鼠脑(Meunier et al.，Nature 377532-535，1995)和从猪的下丘脑(Reinscheid et al.，Science 270792-794，1995)中分离出。该orphanin FQ的氨基酸序列与nociceptin的完全相同，下面将称之为OFQ。Julius(Nature 377476，1995)在对该OFQ发现的注释中提到这个肽的序列与强啡肽A最相似，而强啡肽A是5种确定的鸦片样受体的内源性配体之一。OFQ抑制培养物中CHO(LC 132+)细胞中的腺苷酸环化酶；并且如果将OFQ给药到鼠的大脑内室，就会引起痛觉过敏(Meunier et al.，loc.cit)。结果的型式表明该十七肽是LC132受体的内源性拮抗剂，并且似乎具有前-感受伤害的(pro-nociceptive)性能。Reinscheid et al.(loc.cit.)指出如果将OFQ注入鼠的大脑内室，则会在尾巴-轻拍试验(tail-flick test)(但不是加热板试验(hot-plate test))中降低运动活性并引起痛觉过敏。于是总结出OFQ可作为大脑的神经递质以调节感受伤害的和运动的行为。Vaughan和Christie(Br.J.Pharmacol.1771609-1611，1996)应用脑切片中的整个细胞膜片箝记录研究了OFQ对大鼠的背侧缝核神经元的膜性质的作用，它符合下列报道在背侧缝神经元中存在LC132受体mRNA(Lachowicz et al.，J.Neurochem.6434-40，1995)和G-蛋白质介导的将克隆化LC132受体偶联到活化K通道上(Zhang and Yu，J.Biol.Chem. 27022772-22776，1995)，业已发现LC132受体配体nociceptin有力且有效地增强背侧缝神经元中的内部矫正K传导。
申请人出乎意外地证实LC132受体的拮抗剂如OFQ尤其对精神病和神经病的动物模型有疗效(预示对病人的疗效)，但不局限于焦虑病、癫痫和惊厥的治疗。这就使申请人开发鉴定有用物质的方法和方案从而提出治疗上有用的化合物和/或导致将化合物用于发现治疗上有用的化合物。因此，本发明涉及筛选治疗上有用的化合物的方法，该方法包括在用于精神病和/或神经病的筛选检查中，尤其是用于抗癫痫、抗惊厥或抗焦虑筛选检查中测试一种LC132受体拮抗剂。
在一个优选的实施方案中，治疗上有用的化合物的筛选方法包括在用于精神病和/或神经病的筛选检查中测试一种LC132受体拮抗剂。该方法最好包括将一种LC132受体与推测有LC132受体拮抗剂活性的药剂接触，测试该LC132受体-药剂的结合性和/或测定LC132受体拮抗剂活性，然后测试有拮抗剂活性的药剂在精神病和/或神经病筛选检查、即抗癫痫、抗惊厥或抗焦虑的筛选检查中的应用情况。
术语“LC132受体”或“LC132受体蛋白”表示天然的受体蛋白及其衍生物。得自不同的动物种的该受体或其衍生物在文献中有数个名称，最常用的是ORL1。LC132受体是一种孤独受体，其人体和鼠的互补DNAs近来已得到鉴定，它在结构上类似于鸦片样物质受体(Mollereau et al.，FEBS Lett. 34133-38，1994；Fukuda et al.，FEBS Lett. 34342-46，1994；Chen et al.，FEBS Lett. 347279-283，1994；Bunzow et al.，FEBSLett 347284-288，1994；Wang et al.，FEBS Lett. 34875-79，1994；Lachowicz et al.，loc. cit.；Nishi et al.，Biochem. Biophys.Res. Commun. 2051353-1357，1994和Wick et al.，Molec.Brain Res.2737-44，1995)。LC132受体生物活性的特点在于它对OFQ的强亲和力结合和不能与腺苷酸环化酶偶联(Meunier et al.，loc.cit.；Reinscheidet al.，1995，loc. cit.)。
通常地，优选的LC132受体衍生物其氨基酸序列中至少有80％的氨基酸序列与相应的人LC132受体氨基酸序列相同，优选是至少有90％且最优选是至少有95％相同；其特征在于它们对OFQ有高的亲和力结合。该检查方法的一个特别有利的实施方案包括天然人LC132受体蛋白的应用。
“LC132受体蛋白”这一术语也包括天然或非天然生成的受体蛋白和有关的蛋白质的衍生物，其中至少有部分蛋白质序列可与OFQ肽接合，即天然的LC132受体的一个或多个氨基酸或其片段被取代或者缺失而不失去结合活性。这类衍生物可用已知的肽化学方法或重组DNA技术来制备。“LC132受体蛋白”这一术语还包括这样的衍生物，它可通过该领域中的已知方法从作为残基上的侧链的功能基或者N-或C-端基来制备。这类衍生物可以包括羧基的脂族酯、羧基与氨或与伯胺或仲胺反应而得的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基(例如链烷酰或碳环芳酰基)作用而得的N-酰基衍生物或者游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基作用而得的O-酰基衍生物。
LC132(鸦片样)孤独受体近年来已被鉴定，这是基于与预计的鸦片样受体氨基酸序列的严格的同源性(Mollereau et al.，loc.cit.；Bunzowet al.，loc. cit.；Lachowicz et al.，loc. cit.)。如果在异源体系例如CHO细胞系中表达LC132受体，埃托啡和强啡肽A较弱地抑制环状AMP的形成，但其它的鸦片样物质是惰性的。十七肽OFQ被鉴定为LC132受体的有效的内源性拮抗剂(Meunier et al.，loc. cit.，Reinscheid et al.(1995)，loc. cit.)。LC132转录物在中枢神经系统的数个区内被表达，已知这些区域涉及疼痛调节，它包括下丘脑、脑干和脊髓背侧角(Julius，loc. cit.)。
LC132受体蛋白及其衍生物的表达可通过常见的重组DNA技术来完成。这种技术在文献中有描述(参见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，1989和Ausubel et al.，“Current Protocols inMolecular Biology”，Green Publishers Association & Wiley Interscience，1987)。而且，DNA分子或其编码整个或部分的LC132蛋白质的片断可通过聚合酶链反应(PCR)技术而获得。编码LC132受体的核酸序列可利用大量的宿主/载体组合来表达。有用的表达载体可由染色体、非染色体和合成核酸序列的片段构成。这种载体的实例有病毒载体如各种已知的SV40的衍生物，细菌载体如得自大肠杆菌(E.coli)的质粒，噬菌体DNAs如λ噬菌体衍生物、M13和其它丝状单链DNA噬菌体，还有在酵母中有用的载体如2μ质粒的衍生物，在真核细胞中有用的载体；更优选是在动物细胞中有用的载体如那些含SV40、腺病毒和/或逆转录病毒衍生的DNA序列的载体。
用于表达核酸序列所编码的LC132受体的宿主细胞可以是选自各种已知宿主的细胞，大量宿主得自例如The American Type CultureCollection(ATCC)。用于LC132表达的优选的宿主是哺乳动物细胞如CHO细胞。LC132受体表达细胞系的制备可按该技术中的已知方法例如Reinscheid et al.描述的方法(1995，loc.cit.)。
“LC132受体拮抗剂”这一术语是指可结合到LC132受体上从而调节LC132受体功能的化合物，即在细胞内抑制毛喉素(forskolin)-刺激的腺苷酰环化酶活性，该细胞用可表达LC132受体的载体转化过。典型的拮抗剂是高亲和性配体，优选其IC50值低于1μM，例如OFQ或其衍生物。
“将LC受体与推测有LC132受体拮抗剂活性的药剂接触”这一术语可包括下列特点将一种优选为人LC132受体蛋白的LC132受体蛋白、在适当的缓冲液中连接到固相中；该固相通常是聚氯乙烯，但也可以是其它聚合物如纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯或聚丙烯。固体支持体的存在形式可以是管状、珠状、圆盘状或微量滴定板状、或者是适于实施试验的任何其它表面，其上被动地结合LC132受体，露出高亲和性的受体结合位点。洗涤后，可以在适当的缓冲溶液中加入推测能结合到LC132受体上和/或具有LC132受体拮抗剂活性的药剂。
制备LC132受体的优选的方法其特征在于用含编码LC132受体的核酸序列的载体转染哺乳动物细胞系例如CHO细胞系，接着表达该受体蛋白。然后就可以将含该受体蛋白的纯化了的膜结合到上述固体表面，再与被推测为LC132受体拮抗剂的药剂一起培养。这些方法都是该技术中已知的，例如Reinscheid et al.，loc. cit.阐述了这类方法。此时本发明的方法包括(a)提供含LC132受体的细胞膜，(b)将该膜与被推测为LC132受体拮抗剂的化合物接触，与(c)测定该化合物是否结合到LC132受体上和是否产生拮抗剂专一活性，接着进行精神病和/或神经病筛选检查。
测定推测为一种拮抗剂的药剂与LC132受体的结合情况可通过对该药剂的直接标记或对某竞争性药剂如OFQ的标记来实施。例如可以利用放射性标记物来标记该药剂或该竞争性药剂。Reinscheid et al.(1995，loc.cit.)描述了一个优选的实施方案，也可参见实施例1。
LC132受体拮抗剂活性的药理鉴定，可通过对毛喉素刺激的cAMP在宿主细胞(例如CHO细胞)中积累的抑制程度来确定，而该宿主细胞是用可表达LC132受体的载体转染的。可利用Reinscheid et al.(1995，loc.cit.)所述方法或利用本技术中的其它方法来测定cAMP的浓度。实施例1中叙述了本发明的一个特别优选的实施方案，它包括LC132受体拮抗剂活性的测定。
于是LC132受体拮抗剂可通过精神病和/或神经病筛选而得以进一步表征。术语“精神病和/或神经病筛选检查”是指，但不局限于抗焦虑的、抗癫痫的和/或抗惊厥的筛选检查。本技术中已知的这些检查方法如下述所示抗焦虑试验(Martin & Haefely，cit. loc.)建立了大量动物模型，试图借以预测新的化合物在人体内的抗焦虑活性。这些范例中有许多以所谓的“抵触”情形估测动物的行为，也就是同时在两种对立的动机状态如接近和疏远趋向的影响下行为的响应。也许人们最熟悉的模型是有条件的惩罚抵触范例，其中将动物训练成能为接受奖励(例如对饥饿的动物奖励食物)而自发地表现出一定的响应(例如压杠杆)。一旦动物表现出恒定水平的压杠杆响应，就引入短暂的非常时期(通常发出视觉或听觉信号)，其间对压杠杆行为同时实施食物奖励和轻度的足电击惩罚。在这些抵触期间，动物表现出显著迟钝的响应速度，还发出各种明显的情绪信号。苯并二氮杂受体拮抗剂例如抗焦虑的地西泮的独特效果在于在不破坏未受惩罚的响应的剂量时，对受惩罚行为的脱抑制现象(导致受惩罚下响应速度的提高)。此外，在不存在实际惩罚时，即当压杠杆速度因害怕受惩罚而减慢时，这些相同活性的药物会产生类似抗焦虑的效果。抵触试验不需有条件的行为响应对首次受试验的口渴的动物可以提供饮水的机会，但在其饮水时通过与电喷管接触而进行惩罚。这种惩罚抑制的饮水因苯并二氮杂受体拮抗剂(如地西泮)引起的剂量依赖性而解除。初步的活性可同样因意外的惩罚而降低，且可通过已知的抗焦虑药的治疗而消失掉。无惩罚的抵触模型都基于自然对抗的促动状态的存在，一方面有好奇的趋向，而另一方面又害怕新环境(例如暗-亮室试验、增加的正迷宫、在生疏环境中消耗不熟悉的食物或普通食物、彼此不熟悉的动物之间的合群作用)。显然，可将这些试验场合中苯并二氮杂受体拮抗剂引起的行为抑制解除效果归于类似抗焦虑作用；这些效果也可被解释为转移性因素的影响作用的普遍减弱或甚至降低抑制先天的或有条件的响应的能力。可将苯并二氮杂拮抗剂引起的抗挫折效果归因于响应的增强，该响应因试验场合中响应意外情况的奖励而得以维持，其中的奖励被减轻或省去。通过在动物体内长久植入的电极对中脑水管周围的神经灰质区实施的电刺激是转移性的，并可诱发一系列情绪反应，苯并二氮杂受体拮抗剂能扩大转移阈(aversive threshold)。特点在于行为和生理症状(心血管的、内分泌的)的急性焦虑病态可由下列因素而引起已知的能在人体内产生焦虑的化学药品例如惊厥药如戊二烯亚戊基四唑，服用不够惊厥剂量的针对苯并二氮杂受体拮抗剂的反拮抗剂，或者甚至是长期用高剂量的镇静药治疗后突然停止用药。将幼鼠迅速从其母体身边分开而引起的超声痛苦喊叫可被苯并二氮杂受体拮抗剂减轻。上述范例中苯并二氮杂受体拮抗剂的药理专一性是使人难忘的，而抗抑郁药、止痛药和精神抑制药相对地效果较差些。
抗癫痫/抗惊厥试验(Martin & Haefely loc. cit.)。在人们熟知的用于预防或治愈动物急性癫痫发作的药物中，苯并二氮杂受体拮抗剂是最有效的；引起急性癫痫发作的原因全身服用化学品(如戊二烯亚戊基四唑、吡枯枯灵碱、印防己毒素、GABA生物合成的抑制剂、青霉素、局部麻醉剂、乙酰胆碱酯酶的抑制剂)，在皮层表面上或向室系统中给药(强心苷、谷氨酸盐受体兴奋剂NMDA)，或者长期用于皮层的药物(病灶性铝或钴镇癫痫药)。它们还是有效的保护剂，被用于预防高压性癫痫发作和因下列情况而导致的癫痫发作(激动性癫痫发作)在边缘系统中从阈下的强度开始进行长久的间歇性电刺激后而引起的癫痫发作。电惊厥性癫痫也可用多数(但不是全部)苯并二氮杂受体拮抗剂来预防，不过剂量要比防止化学药物引发的癫痫所用的剂量高得多。癫痫的各种遗传模型(大鼠中的癫痫小发作状表现型、易发生遗传的小鼠种中因声觉刺激而引发的癫痫或者在易发生遗传的狒狒中因光刺激而引发的肌阵挛性癫痫)对苯并二氮杂受体拮抗剂有响应。因此，苯并二氯杂受体拮抗剂对目前所有的动物癫痫模型都有疗效，可以预测它对多数人癫痫形式或惊厥病态有疗效。与其宽泛的癫痫样抗惊厥活性相一致，苯并二氮杂受体拮抗剂可预防或抑制下列癫痫样电活性即由体外保存的脑切片、尤其是海马切片中的各种操作(惊厥剂、离子型组合物)引起。它们还可减轻在各个脑区内由电刺激引起的神经元的后释放。还发现苯并二氮杂受体拮抗剂可减轻病灶内的癫痫样活性，还可抑制泛化。
将如前所述的一种LC132受体拮抗剂即OFQ注射入小鼠的脑内室，并在测试抗焦虑效果的试验(自发反应抵触试验、亮-暗试验，实施例2和3)中观测动物。已证实在两个试验范例中OFQ表现出抗焦虑效果。此外，证实脑内室注射的OFQ在小鼠的癫痫模型(听原性癫痫模型，实施例4)中有活性，它预示的普遍抗惊厥效果和对患者的抗癫痫作用。文献中未报道过OFQ的这类有效的治疗效果。
下述的实施例1、2、3和4中描述了优选的试验对LC132受体拮抗剂活性的测定和对毛喉素刺激的cAMP积累的抑制(实施例1)，表明OFQ可抑制在用LC132转染的CHO细胞内由毛喉素刺激的cAMP积累，这与未转染的CHO细胞形成对照。在用LC132受体转染的CHO细胞内，OFQ抑制毛喉素刺激的cAMP积累其半数效应浓度(EC50)为1.05±0.21nM，而达到大约80％抑制的极大效果是在100nM。它对未转染的细胞无效果。为了测定OFQ对其受体的结合动力学，研制出并鉴定了放射性配体[125I]Tyr14-orphanin(Reinscheid et al.，J. Biol. Chem.27114163-14168，1996)。将[125I]Tyr14-orphanin结合到从CHO细胞制得的膜上，所述细胞以可饱和的和不可取代的方式表达LC132受体，其中Kd为56.2±7.3pM，而Bmax大约为200fmol/mg蛋白质。OFQ抑制[125I]Tyr14-orphanin对LC132受体的结合，其抑制常数(Ki)为0.19±0.02nM(Reinscheid et al.(1996)，loc.cit.)。
抗焦虑效果的白发反应抵触试验(实施例2)表明与载体注射(平均值)±标准平均误差＝36.3±7.4)相比，OFQ(平均值±标准平均误差＝24.6±3.6)不明显地减弱未受惩罚的响应，它预示极小的运动损伤；反之，与载体注射(平均值±标准平均误差＝4.3±1.6)相比，OFQ(平均值±标准平均误差＝16.2±6.0)显著地(P＜0.05)增强受惩罚的响应，它预示抗焦虑效果。该结果模式类似于使同样的这两组小鼠口服商品化抗焦虑药地西泮后的结果，它预示OFQ作为一种抗焦虑药对病人的疗效。
测试抗焦虑效果的亮-暗盒试验(light-dark box task)(实施例3)表明与载体注射(平均值±标准平均误差＝11±5sec)相比，在0.3nmol/小鼠(平均值±标准平均误差＝54±14sec)和1nmol/小鼠(平均值±标准平均误差＝58±19sec)的剂量下，OFQ显著地(P′s＜0.05)提高了小鼠在亮盒中逗留的时间。而且，与载体注射(平均值±标准平均误差＝3.0±0.5)相比，在0.3nmol/小鼠(平均值±标准平均误差＝1.2±0.6)、1nmol/小鼠(平均值±标准平均误差＝0.7±0.2)和3nmol/小鼠(平均值±标准平均误差＝0.4±0.3)的剂量下，OFQ也显著地(P′s＜0.05)减少了小鼠的持移欲望。该结果预示OFQ的抗焦虑活性。
听原性癫痫发作模型(实施例4)表明OFQ对于遗传上对声音敏感的小鼠因声音而引起的紧张性惊厥有防护效果，其ED50值为0.7nmol/小鼠。该结果预示了OFQ对癫痫和减轻惊厥的治疗效果。
因此，本发明还涉及可通过前述方法得到的化合物，例如OFQ及其衍生物；还涉及包括一种或多种这类化合物与一种治疗上呈惰性的载体材料的药物组合物。此外，本发明还涉及这类化合物在制备用于治疗精神病和/或神经病的组合物方面的应用；也涉及治疗精神病和/或神经病的方法，该方法包括用治疗有效量的OFQ或其衍生物给药。精神病和/或神经病的实例有癫痫、焦虑或惊厥。
“OFQ及其衍生物”这一术语是指肽F-G-G-F-T-G-A-R-K-S-A-R-K-L-A-N-Q、其片段和/或其非天然存在的肽或其突变体。这类衍生物是指这样的肽即天然OFQ肽或其片段中的一个或多个氨基酸被取代或缺失但未损失拮抗剂活性。这类衍生物可用肽化学中的已知方法制备。
“OFQ及其衍生物”这一术语还包括这样的衍生物它通过本技术中已知的方法、从残基上作为侧链的官能基或N-或C-端基来制备，这种衍生物只要在药物上可被接受，即它们不会破坏肽的拮抗剂活性、不会给含它们的组合物带来毒性，就可包括在本发明中。这些衍生物可包括例如聚乙二醇侧链，它可掩蔽抗原位点和/或延长OFQ肽衍生物在体液中的滞留时间。其它衍生物包括羧基的脂族酯、羧基与氨或与伯胺或仲胺反应而得的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基(例如链烷酰或碳环芳酰基)作用而形成的N-酰基衍生物或游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基作用而形成的O-酰基衍生物。
“OFQ及其衍生物”这一术语还包括上述衍生物的可溶形式，该可溶形式可通过本技术中的已知方法例如通过化学合成而制备。
服用OFQ及其衍生物的剂量范围可由本领域中普通技术人员来确定而不必实施过多试验。总之，适当剂量为只要大到足以产生期望的效果。剂量不能大到引起相反的副作用，如不希望的交叉反应、过敏性反应等等。一般地，剂量将随病人的年龄、状况、性别和病情程度、禁忌症-如果有的话，免疫耐受性和其它类似的变量而改变，它可由各个医师自己决定。预期的剂量范围是约0.1ng/kg/天～约0.1mg/kg/天。OFQ肽及其衍生物的给药方法可以是肠胃外注射、或随时间逐渐灌注，也可通过静脉内、腹膜内、肌内或皮下给药。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌的或水溶性的或非水溶性均溶液、悬浮液和乳浊液。非水溶性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水溶性载体包括水、醇/水溶液、乳浊液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格氏溶液、或不易挥发的油。静脉用载体包括如那些基于林格氏葡萄糖的液体和营养素再生剂、电解质再生剂等等。也可存在防腐剂和其它添加剂例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。一般可参见Remington’s Pharmaceutical Science，18thEd.，Mack Eds.，1990。
本发明还涉及可通过前速方法获得的化合物，涉及包括一种或多种这类化合物和一种治疗上呈惰性的载体材料的药物组合物。
进一步地，本发明包括LC132受体在筛选下列治疗中有用的化合物的筛选检查中的应用，即在精神病和/或神经病的治疗、尤其是在前述的焦虑、癫痫及惊厥方面的治疗中有用的化合物。
通过下述实施例将详细地阐述本发明、但不以任何方式限制本发明。
实施例实施例1LC132拮抗剂活性的测定和毛喉素刺激的cAMP积累的抑制为进行cAMP浓度的测定，将LC132受体转染的CHO细胞或CHO dhfr-(野生型)细胞置于24孔的板上并让其长到铺满为止。除去培养介质，将待试验化合物或肽溶于含10mM HEPES(pH 7.4)1mM毛喉素和1mM Ro20-1724(可从RBI获得)、总体积为0.2ml的Dulbecco’s Modified EagleMedium后加入，然后将这些细胞在37℃下培养10min。加入0.5ml冰冷的乙醇而停止反应，并将这些板在-80℃下冷冻12小时。将板进行离心处理，除去其中的上层清液部分，再干燥后用于cAMP测定。按制造商的说明实施cAMP测定(Biotrak SPA，Amersham)。配体结合试验是在96孔深底微孔板上实施的。收集稳定地表达LC132受体的CHO细胞，使其再悬浮于含50mM Tris-HCl(pH7.8)、5mM MgCl2、1mM EGTA、0.1％BSA和抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素各0.1mg/ml的10倍体积的结合缓冲液中。应用组织匀浆器(setting 4 for 30sec；PT20，Kinematica，Lucerne，Switzerland)来制膜。在4℃下、于45,000×g下离心10min后得总的膜颗粒。将所得沉淀按上述方法实施两次再悬浮和离心处理，最后用适当体积的结合缓冲液将膜稀释，并于-70℃下贮存。利用BCA Protein Assay Kit(Pierce)来测定蛋白质浓度。在室温下和总体积为200μl的结合缓冲液中，将[125I]Tyr14-orphanin与膜(10-18μg蛋白质)一起培养1小时。为进行竞争结合试验，一同加入50,000cpm的[125I]Tyr14-orphanin(62.5pM)和所需浓度的、未标记的肽。在50nM OFQ的存在下测定非特异性结合。通过WhatmanGF/C滤器利用Brandel多道采集机(Brandel multichannel harvester)实施快速真空过滤而分离结合的和游离的配体。先用含0.1％BSA的、0.3％聚亚乙基亚胺在室温下对GF/C滤器预处理1小时。将滤器用1ml pH7.5、冰冷的50mM Tris-HCl洗涤6次，然后用γ计数器来计数。
实施例2抗焦虑效果的自发反应抵触试验采用雌性患白化病的小鼠(IbmMORO(SPF)；Biological ResearchLabs，Fullinsdorf，Switzerland)。在试验的起始点时，这些小鼠至少是2-3月大的、且预先接受过自发反应抵触工作(operant conflicttask)的良好训练。将这些小鼠分别置于底层铺上木屑的Macrolon型塑料笼(大约13×23×13cm)中。调节鼠笼中的温度和湿度，将鼠笼维持在自然的亮-黑循环状态。自来水可随意地获取，但接触标准的实验食物受到限制。将小鼠的体重维持在其自由进食时的大约80-85％。训练和试验方法由Martin et al.(Pharmacol. Biochem. Behav. 46905-910，1993)提供对不允许进食的小鼠在工作中实施良好的训练，其中在初始5分钟内每压一次杠杆(未受惩罚的响应)就自动地提供一次食物奖励；然后在随后的15分钟内对于每次压杠杆(受惩罚的响应)，在给予食物奖励的同时伴随一次轻度的足电击。与文献中报道的相符，即试验前30分钟口服10mg/kg的地西泮会导致未受惩罚下的响应一定程度上的减弱，但增强了这些小鼠受惩罚下的压杠杆行为。将小鼠分为两组(N′s＝9)。脑内室注射量为2μl，载体系人造脑脊髓液。给定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)的剂量为3nmol/小鼠。对抵触试验的两部分即未受惩罚的(即在抵触试验的前5分钟内)和受惩罚的(即抵触试验后续15分钟期间压杠杆同时得到食物和电震)进行评定。有关各只小鼠的处理条件对参加小鼠的行为评定的技术人员保密(未告诉他)。采用Mann-WhitneyU检验对照两个处理组进行统计分析，认为p值小于0.05是统计上显著的。
实施例3测试抗焦虑效果的亮暗盒工作(light-dark box task)采用雄性患白化病的小鼠[IbmMORD(SPF)；Biological ResearchLabs，4414 Fullingsdorf，Switzerland]。试验前，将小鼠置于分组的笼中关数天、笼的底层铺有木屑。调节室温和温度，并使鼠笼处于相反的亮-暗循环。自来水和标准的实验食物可随意地获取。在亮暗盒工作中测定初次受试验的小鼠中的初步活性。该试验装置是由通过一条不透光的塑料管(5×7×10cm)联结的同样大小(20×20×14cm)的、一只透光和一只不透光的Plexiglas盒构成的。透光盒中处于照亮状态(盒中部的照度为4400勒克司)。脑内室注射5分钟后，将一只小鼠置于塑料管内使其面向暗盒。在5分钟内记录小鼠在亮盒中逗留的时间、有转移欲望(只有头部和前爪进入亮盒中)的次数、以及完全从不透光的盒内转入透光的盒中的次数。四只爪子全进入另一个盒中的小鼠被认定是已转移了盒室。每次试验后彻底净化盒底；每个试验组由10-20只小鼠构成；脑内室注射的体积为2μl；给定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)的剂量为3、1、0.3和0.1nmol/小鼠。用人造脑脊髓液作载体。有关各只小鼠的处理条件对参加小鼠的行为评定的技术人员保密(未告诉他)。用学生t-检验评定各处理组之间的差别，认为p值≤0.05是统计上显著的。实施例4测试抗癫痫/抗惊厥效果的听原性癫痫发作模型采用幼鼠[DBA/2J(SPF)；Biological Research Labs，4414Fullinsdorf，Switzerland]。试验前，将小鼠关在底层铺上木屑的笼子里。调节室温和湿度，并使鼠笼处于自然的亮-暗循环。自来水和标准的实验食物可随意地获取。研究对初次受试验的3周大的DBA/2J小鼠(已知它们在遗传上易发作癫痫)的听原性癫痫发作的防护效果。有关该试验的其它细节另有报道(Martin et al.，Psychopharmacology 111415-422，1993)。简言之，紧接着脑内室注射后，将每只小鼠置于各别的底层铺上木屑、开着的透光Plexiglas盒(21×44×21cm)中。在隔音室中实施试验，包括使小鼠接受1分钟的在110dB(将0dB定义为20μPa的压力值时、14kHz正弦曲线样的音调，其间记录观察结果。处理5分钟之后实施听觉刺激。8只小鼠一组地用于评定每个剂量和载体条件，脑内室注射量为2μl；给定OFQ(Research Genetics，Inc.，Huntsville，Alabama)为10、3、1、0.1和0.01nmol/小鼠；将人造脑脊髓液用作载体；有关各只小鼠的处理条件对参加小鼠的行为评定的技术人员保密(未告诉他)。记录未表现紧张性惊厥的小组部分，用概率分析计算ED50值。
权利要求
1.一种筛选治疗上有用的化合物的方法，该方法包括在对于精神病和/或神经病的筛选检查中测试一种LC132受体拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中对给定化合物的LC132受体拮抗剂活性的测定包括将LC132受体与推测为LC132受体功能的拮抗剂的药剂接触，接着测试该给定化合物与受体的结合和/或拮抗剂活性。
3.权利要求2的方法，它包括(a)提供含LC132受体的细胞膜；(b)将该膜与推测为LC132受体拮抗剂的化合物接触；和(c)测定该化合物是否结合到LC132受体上和是否产生了拮抗剂专一活性。
4.权利要求3的方法，其中的拮抗剂专一活性是通过测定对毛喉素激发的cAMP积累的抑制而确定的。
5.权利要求1的方法，其中的拮抗剂是一种对LC132受体有高亲和性的配体。
6.权利要求5的方法，其中的LC132受体拮抗剂的特征是IC50值小于1μM。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中用于精神病和/或神经病的筛选检查是一种有关抗癫痫、抗惊厥或抗焦虑的筛选检查。
8.权利要求6的方法，其中所述的精神病和/或神经病的筛选检查是指自发反应抵触试验、亮-暗盒试验或听原性癫痫发作模型。
9.权利要求1-8中任一项的方法在对于精神病和/或神经病的治疗中有用的化合物的筛选中的应用。
10. Orphanin FQ及其衍生物在制备用于治疗精神病和/或神经病的药剂中的应用。
11.权利要求10的应用，其中的病是指癫痫、焦虑和惊厥。
12.用于治疗精神病和/或神经病的Orphanin FQ及其衍生物。
13. LC132受体蛋白在对于精神病和/或神经病的治疗有用的化合物的筛选中的应用。
14.一种药物组合物，它包括与治疗上可接受的载体相组合的权利要求10中规定的化合物。
15.用于治疗精神病和/或神经病的方法，该方法包括用治疗有效量的、权利要求10中所规定的化合物给药。
全文摘要
本发明涉及一种治疗上有用的化合物的筛选的方法,该方法包括在精神病和/或神经病的筛选中测试一种LC132受体拮抗剂。更确切地说,该筛选方法基于:将LC132受体与推测为LC132受体功能的拮抗剂的药剂接触,接着测试该化合物的结合性和/或拮抗剂活性,然后测试有LC132拮抗剂活性的药剂在抗癫痫、抗惊厥或抗焦虑的筛选中的效果。
文档编号G01N33/15GK1184254SQ9711321
公开日1998年6月10日 申请日期1997年6月12日 优先权日1996年6月13日
发明者O·西维尔, J·R·马蒂恩, F·蒙斯玛, J－L·莫里奥, H－P·诺斯艾克, R·雷恩施德 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
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