专利名称：肌酐含量测定方法及肌酐诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定肌酐含量的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的肌酐诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法等。
化学测定法——成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。
高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析，通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某些科研目的。
毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。
酶学测定法——主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物—还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的肌酐含量的测定方法，同时给出实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行肌酐含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定肌酐含量的方法步骤如下1)、将样品与主要由还原性辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用肌酐酶偶联肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及苹果酸脱氢酶反应连续监测法或比色法。肌酐酶将肌酐变成肌酸，再通过偶联肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及苹果酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的幅度，通过测量340nm处吸光度下降的幅度，可以测算肌酐的含量。
实现本发明方法的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40——200mmol/l还原性辅酶 0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l肌酐酶 1000——50000U/l肌酸酶 1000——50000U/l尿素酶 1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l苹果酸脱氢酶2000——20000U/l稳定剂 10——80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源肌酸、尿素、碳酸氢根污染试剂I缓冲液 40——200mmol/l还原性辅酶 0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸1——20mmol/l肌酸酶 1000——50000U/l尿素酶 1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000——20000U/l苹果酸脱氢酶2000——20000U/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂II缓冲液 40——200mmol/l肌酐酶 1000——50000U/l稳定剂 10——80％(总体积)
双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原性辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，肌酐酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源肌酸、尿素、碳酸氢根污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液40——200mmol/l还原性辅酶0.15——0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1——20mmol/l稳定剂10——80％(总体积)试剂II缓冲液40——200mmol/l肌酸酶1000——50000U/l尿素酶1000——50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2000——20000U/l苹果酸脱氢酶 2000——20000U/l稳定剂10——80％(总体积)试剂III缓冲液40——200mmol/l肌酐酶1000——50000U/l稳定剂10——80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原性辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中。试剂III其中的成分，肌酐酶也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明肌酐诊断试剂盒较为理想缓冲液80——120mmol/l还原性辅酶0.2——0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2——8mmol/l肌酐酶6000——10000U/l肌酸酶6000——10000U/l尿素酶20000——40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000——20000U/l苹果酸脱氢酶 10000——20000U/l
稳定剂20——50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源肌酸、尿素、碳酸氢根的污染，消除内、外源肌酸、尿素、碳酸氢根的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源肌酸、尿素、碳酸氢根已经被消耗殆�。诤蟀攵问奔洳馐约◆克枰募∷�、尿素、碳酸氢根都是产生于肌酐的含量。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的肌酐诊断试剂盒包括缓冲液80mmol/l还原性辅酶0.2mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l肌酐酶6000U/l肌酸酶6000U/l尿素酶20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶10000U/l苹果酸脱氢酶 10000U/l稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出肌酐的含量。
本实施例本发明应用肌酐酶偶联肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及苹果酸脱氢酶反应连续监测法或比色法。肌酐酶将肌酐变成肌酸，再通过偶联肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及苹果酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的幅度，通过测量340nm处吸光度下降的幅度，可以测算肌酐的含量。
实施例二(双剂)本实施例的肌酐诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l还原性辅酶 0.25mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸5mmol/l肌酸酶 8000U/l
尿素酶30000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶15000U/l苹果酸脱氢酶 15000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l肌酐酶8000U/l稳定剂50％(总体积)测定肌酐含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出肌酐的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的肌酐诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/l
还原性辅酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液120mmol/l肌酸酶10000U/l尿素酶40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶20000U/l苹果酸脱氢酶 20000U/l稳定剂50％(总体积)试剂III缓冲液120mmol/l肌酐酶10000U/l稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出肌酐的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的肌酐诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l还原性辅酶0.3mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 4mmol/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液100mmol/l肌酐酶6000U/l肌酸酶6000U/l尿素酶40000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶20000U/l苹果酸脱氢酶 20000U/l稳定剂50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出肌酐的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种肌酐含量测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由还原性辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应肌酐+水肌酸酐酶肌酸肌酸+水肌酸酶肌氨酸+尿素尿素+水尿素酶碳酸氢根+氨离子碳酸氢根+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出肌酐含量的大小。
2.根据权利要求1所述肌酐含量测定方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速(程)度，测算出肌酐的含量。
3.根据权利要求1或2所述肌酐含量测定方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述肌酐含量测定方法，其特征在于被测肌酐样品与试剂的比例控制在1/10到1/500。
5.一种肌酐诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40--200mmol/l还原性辅酶 0.15--0.5mmo/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l肌酐酶 1000--50000U/l肌酸酶 1000--50000U/l尿素酶 1000--50000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l苹果酸脱氢酶 2000--20000U/l稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，
9.根据权利要求8所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
10.根据权利要求9所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐含量的方法，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、还原性辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸、肌酐酶、肌酸酶、尿素酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出肌酐的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1766641SQ200410065168
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月28日 优先权日2004年10月28日
发明者王尔中 申请人:王尔中
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
