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专利名称：一种尿液中cema和hema的液相色谱串联质谱测定方法
技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液样本的巯基尿酸测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中N-乙酰基-S-(2-腈基乙基)-L-半胱氨酸(CEMA)和N-乙酰基-S- (2-羟基乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)含量的方法。
背景技术：
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丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a，b-不饱和腈类化合物。它可以通过代谢活化后形成活性更强的环氧型中间体，进一步与体内的细胞大分子的亲核中心共价结合，从而造成机体的损伤。体外毒理学实验和流行病学调查数据显示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC将其归为可能的人类致癌物。丙烯腈存在于卷烟烟气中(7.8-39.1 yg/支烟)，普通人群可以通过吸入卷烟烟气接触丙烯腈，从而增加健康风险。丙烯腈进入体内后于可以直接或通过代谢活化后于GSH，形成两种巯基尿酸代谢物:CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不仅能提供丙烯腈及其可能的代谢中间物及其与GSH结合机制的有关信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在体内的代谢状况。2007年，Scherer等研究了 CEMA和HEMA等生物标志物与抽吸卷烟原型物释放量之间的关系，用于评估接触风险。LC-MS/MS可以用于测定尿液中的CEMA和HEMA含量，并应用于吸烟人群的生物监测。由于尿液中CEMA和HEMA在普通人群中的含量较低、尿液基质较为复杂使得一些已经建立的LC-MS/MS方法在检测非吸烟者尿液中的CEMA和HEMA时受到限制。分析柱填料粒径低于2 μ m的液相色谱的出现为复杂生物混合物提供了更好的分离能力，其与质谱的联用，降低了分析物的检出限及质谱检测的离子抑制现象，并提高了分析速度，从而可以实现快速、高通量的分析。本发明以尿液中的CEMA和HEMA为研究对象，建立了直接稀释进样快速高分辨液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)测定人体尿液中的CEMA和HEMA方法。发明内容:
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用LC-MS/MS测定卷烟尿液中CEMA和HEMA含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中CEMA和HEMA的含量，测定结果准确、测定干扰少。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:尿液中CEMA和HEMA含量的测定方法，包括以下工艺步骤:
a、收集志愿者尿液。b、样品前处理:尿液在室温下解冻，混合均匀。准确移取1.0 mL的尿液并加入10μ L的甲酸酸化,在10000 rpm的条件下离心`10 min。取上清液过0.22 μ m的聚醚砜水相滤膜。移取100 μ L的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶,加入100 μ L混合内标,加入800 μ L
0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μ L进LC-MS/MS分析。C、利用甲醇配制不同浓度的标准工作溶液d、LC-MS/MS测定，吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，CEMA和HEMA的线性回归方程为y=0.0508+0.00356和y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。在本发明中，所述混合内标为氘代内标，氘代内标浓度为I Pg/mL。本发明中选取了选取了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (RRHT 2.1 X 50 mm,1.8 μπι)色谱柱，流动相A:0.1%甲酸水溶液，流动相B:0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱条件:0-1 min,95% A -95% A;1_3 min, 95% A - 5% A ;3_4.5 min,5% A；4.5-5 min,5% A - 95%A ；5-6 min, 95% A，分析时间为6 min，进样量为2 μ L。串联质谱检测器的条件:电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；喷雾电压
(IS):-4400V，雾化气(Gasl):55 psi，气帘气压力(CUR):35 psi，辅助雾化气(Gas2):50psi，离子源温度(TEM):530。C，进口电压(EP):-10 V，出口电压(CXP):-10 V，驻留时间:100 ms ο监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1:
表I CEMA和HEMA及其氣代标准品的保留时间以及部分质谱参数
权利要求
1.一种尿液中CEMA和HEMA的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于:包括以下工艺步骤: a、收集志愿者尿液； b、样品前处理:尿液在室温下解冻，混合均匀，准确移取1.0 mL的尿液并加入10 μ L的甲酸酸化，在10000 rpm的条件下离心10 min,取上清液过0.22 μπι的聚醚砜水相滤膜，移取100 μ L的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶，加入100 μ L混合内标，加入800 μ L 0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μ L进LC-MS/MS分析； C、标准工作液的配制:用甲醇配制不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液； d、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定，吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，CEMA的线性回归方程为y=0.0508+0.00356，HEMA的线性回归方程为y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度，相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于:混合内标为氘代内标，氘代内标浓度为 I Pg/mL。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于:在LC-MS/MS测定中，选取了AgilentZorbax Eclipse Plus C18 (RRHT 2.1 X 50 mm, 1.8 Mm)色谱柱，流动相 A:0.1% 甲酸水溶液，流动相B:0.1%甲酸乙腈；采用梯度洗脱，分析时间为6 min，进样量为2 μ L。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于:梯度洗脱条件:0-1min, 95% A - 95%A ；1-3 min, 95% A -5% A ;3_4.5 min,5% A ；4.5-5 min,5% A -95% A ；5~6 min,95% A，流动相流速为400 μ L/min。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于:串联质谱检测器的条件:电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；喷雾电压(is):-4400V，雾化气(Gasl):55 psi，气帘气压力(CUR):35 psi，辅助雾化气(Gas2):50 psi，离子源温度(TEM):530 ° C，进口电压(EP):-10 V，出 口电压(CXP):-10 V，驻留时间:100 ms。
全文摘要
一种尿液中CEMA和HEMA的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.收集志愿者尿液，b.样品前处理，c.标准工作溶液的配制，d.液相色谱-串联质谱测定。本发明的特点是样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中CEMA和HEMA的含量水平。本发明为全新的尿液中CEMA和HEMA含量的测定方法，采用氘代标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差；串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。
文档编号G01N30/72GK103115993SQ20121058831
公开日2013年5月22日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者侯宏卫, 张小涛, 田永峰, 刘彤, 陈欢, 韩书磊, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心