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专利名称：用于生物分子相互作用实时检测的干涉成像方法及其系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及用来实现高通量、高精度、无标记、实时传感 蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-效应物、抗原-抗体、配体-受体、药物-靶等生物 分子相互作用的方法及其蛋白质芯片检测系统。
背景技术：
生命科学已经进入蛋白质组学研究时代。蛋白质组学是研究一种基因组所表达的 全套蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。它必须在大规模水平上 才能研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰以及蛋白质与蛋白质的相 互作用等；同时，还注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境 (分子)的关系。人体中，蛋白质不仅数量比基因多，而且具有时空特性比基因复杂，如何检 测成千上万种蛋白质间以及蛋白质与其它生物大分子间的相互作用是蛋白质组学所面临 的挑战。需要强调，蛋白质组的研究不仅能为透切理解生命活动规律提供理论和实验，也能 为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间 的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，成为新药物设计的分子 靶点或为疾病的早期诊断提供分子标志。其实，那些世界范围内销路最好的药物本身就是 蛋白质或其作用靶点也为某种蛋白质分子。正因为如此，基因组学的检测技术还不能满足 蛋白质组学的要求，蛋白质组学检测技术应具备的特点一是高通量，一次可以检测几十、 几百甚至成千种蛋白质；二是高灵敏度，人体中各种蛋白质的丰度即含量相差达几亿倍，必 须高灵敏度才能适应检测低丰度蛋白质的要求；三是实时，有时蛋白质之间的相互作用可 能瞬时即逝，必须及时捕足。基于表面等离子体共振(surface ρlasmon resonance，简称SPR)的生物传感是一 种具有高灵敏度、实时、无标记等特点的光学检测方法，被认为是检测生物分子相互作用的 较理想方法。SPR生物传感的检测方法主要有角度扫描、光强检测和相位检测等，其中相位 检测的灵敏度较高。在相位检测中，又有外差、马赫-泽德干涉、空间调制与时域调制干涉 成像等方法，其中时域调制干涉成像法能实现的检测通量更高。为此，本专利发明人已提出 了基于时域相位调制干涉的表面等离子体共振阵列生物传感方法及系统(参见中国专利 号ZL200510086332. 7)，基本原理如图1所示。光源101发出的平行光透过棱镜102和折射 率匹配层103，入射到传感芯片的玻璃基底104和镀在其上的金膜105之间的界面上，金膜 的厚度为30-50nm，并从该界面反射。当入射光位于共振角上时，激发金膜表面的等离子体 共振，使得从玻璃基底104和金膜105之间的界面上反射的光的相位随金膜表面介质折射 率的改变而剧烈变化。反射光透过折射率匹配层103、棱镜102和一维扩束镜106后，射入 电光晶体107。电光晶体107由高压调制电源108控制，可以在其上施加5种不同的电压。 随之，当光通过电光晶体107后，反射光的P和S偏振分量之间就被附加上对应的5个不同 相位差。调制后的光在通过偏振棱镜109时，P偏振光和S偏振光发生干涉，干涉图像经成 像透镜110后，成像在CXD 111上。CXD 111上图像的采集与高压调制电源108输出的对4应电压同步，高压调制电源108输出5种不同的电压为1个周期，对应采集5帧图像也为1 个周期。高压调制电源108可以不断循环输出电压，对应的干涉图像也可以持续循环采集。 接着，利用Hariharan算法，对在同一个周期中所采集的相邻的5帧干涉图像进行解算，得 到即时反射光的相位变化。理论上，只需一个CCD的像素，利用这种方法就可检测传感芯片 上的一个传感点，能实现很高通量的检测。然而，当在电光晶体107上施加高电压时，随之 会出现逆压电效应，造成电光晶体的结构发生微尺度的变化，引起光路微小偏移，即光斑位 置移动，直接产生测量误差，难以达到高精度的要求。这是电光晶体固有的缺陷，无法弥补。 不仅如此，该方法是分时而不是同时采集5帧图像，尽管间隔时间较短，然而也只能算“准 实时”，而不是真正意义上的实时。这样，生物反应中的瞬时变化就很难捕捉到，这种变化却 很可能是重要的生物信息。

发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种新的用于生物分子相互作用实 时检测的干涉成像方法及系统，能够高通量、高精度、实时、无标记检测蛋白质芯片，获取蛋 白质分子之间以及蛋白质与其它生物分子相互作用的信息。本发明提供了一种用于生物分子相互作用实时检测的干涉成像方法，其特征在 于，该方法是基于表面等离子体共振阵列生物传感原理，光源发出的光经准直再通过偏振 棱镜，并经扩束后射到传感单元中；从传感单元反射的光经二分之一波片、成像镜头和偏振 分束棱镜后，分成透射和反射2路光，该2路光的传播方向正交，且同时分别干涉成像在2 台CXD上，2路干涉图像的相位差为180° ；计算机实时从2台CXD上采集到相位差为180° 的2帧干涉图像，通过解算该2帧干涉图像，得到1张反映即时金膜表面的折射率分布信息 图；不断测量传感单元中连续发生的反应，得到一系列折射率分布随时间变化的实时信息 图。本发明具体包括以下步骤1)半导体激光器发出的光经过光纤耦合和准直后，再通过偏振器，得到偏振方向 可调的线偏振准直光束；2)所述的线偏振准直光束通过扩束镜后，入射到生物传感单元中的传感芯片的玻 璃基底与金膜之间的界面上，激发金膜上的表面等离子体共振，同时又从该界面反射；3)所述的反射光通过二分之一波片，该二分之一波片的快轴方向与S偏振方向成 22. 5°角，以便调整反射光的偏振状态，接着通过成像镜头，由成像镜头将金膜表面成像；4)通过成像镜头的光又射入偏振分束棱镜，经过偏振分束棱镜后被分成传播方向 为正交的2路偏振光，同时每路偏振光均产生干涉，2路偏振光所产生的干涉图像的相位差 为180°，分别投射在2台CXD上，即将干涉图像成像CXD上，2路偏振光的干涉图像都包含 同一金膜表面的折射率分布信息；5)计算机实时采集成像在2台CXD上的干涉图像，即相位差为180°的2帧图像， 并进行存储与处理；6)计算机利用采集到相位差为180°的2帧干涉图像，根据公式
计算出这2帧干涉图像所反映的金膜表面折射率分布，即得到折射率分布信息 图；式中，I0为其中一帧干涉图像的灰度，I180为另一帧干涉图像的灰度；7)生物反应不断进行，计算机持续采集干涉图像，实时解算所采集到的干涉图像， 便得到一系列反映生物分子相互作用所对应的折射率变化信息图。基于上述的折射率变化信息图，可从中解析出所检测生物分子的特异性、亲和力 以及动力学常数等，提供给生物医学专家用于疾病诊断或发现新药靶与开发新药。本发明还提供了一种基于上述方法的用于生物分子相互作用实时检测的干涉成 像系统，其特征在于包括产生准直光的入射臂，接收准直光并激发表面等离子体共振的 生物传感单元，将从生物传感单元射出的光分成正交的2路偏振光且分别干涉成像的反射 臂，以及包含获取干涉图像的2台CCD和计算机的信号采集处理单元；所述入射臂中的偏振激光准直部分包括半导体激光器、依次设置在半导体激光 器出射光路中的单模光纤、激光准直器、偏振棱镜和扩束镜；所述半导体激光器的波长为600-900nm;所述入射臂中的扩束镜的扩束倍数为 2-8 倍。所述生物传感单元利用表面等离子体共振的原理，包括接收从入射臂射出的光的 直角或梯形棱镜，置于直角或梯形棱镜底面的折射率匹配层，置于折射率匹配层下的传感 芯片以及位于传感芯片下面的流体池；该传感芯片由玻璃基底以及镀在该玻璃基底的下表 面上的30-50nm厚的金膜，其中棱镜、折射率匹配层和传感芯片玻璃基底的折射率相同；所 述的折射率匹配层为与棱镜及传感芯片玻璃基底折射率相同的折射率油膜。所述反射臂中包括设置在生物传感单元出射光路中的二分之一波片、成像镜头和 偏振分束棱镜，其中二分之一波片的快轴方向与S偏振方向成22. 5°角(以便于调整反射 光的偏振状态；成像镜头将金膜表面成像，偏振分束棱镜使从成像镜头射入的光分成传播 方向正交且偏振方向正交的2路且产生干涉，同时还分别投射在2台CXD上，即将金膜表面 的干涉图像成像在C⑶上，2帧干涉图像的相位差为180° )；所述信息采集处理单元包括2台C⑶或CMOS以及与之相连的计算机；2台CXD分 别正对着从偏振分束棱镜正交射出的2路干涉偏振光，且CXD正好位于成像透镜的焦面上 (即干涉图像同时成像在2台C⑶上；计算机从2台CXD中实时采集到相位差为180°的 2帧干涉图像，利用这2帧图像计算出即时金膜表面的折射率分布，即为即时的金膜表面的 折射率分布信息图)。本发明的特点及有益效果本发明采集到的2帧干涉图像是金膜表面同一时刻的实像，没有任何时间差，实 现了真正意义上的实时获取图像，优于任何移相调制干涉成像法。信号处理的优点是得到 的折射率变化的信息图与初始的光强分布无关，避免了光强分布的不均勻性带来的误差， 同时还抑制光强漂移造成的测量误差。生物分子相互作用不断进行，干涉图像连续采集，折 射率变化分布图实时得到，从而可以实时检测或监控生物分子相互作用。在整个系统中，无论是入射臂，还是反射臂，既没有电光调制器件，更没有运动元 件或部件，且在偏振分束棱镜前都是共光路，稳定可靠，有利于提高检测灵敏度和可靠性， 这是本发明的最大特点。本发明提供的方法以及利用该方法实现的系统，可以高通量、高精度、实时和无标记检测，获取生物分子相互作用的信息，提供给生物医学和药物研究人员，进行蛋白组学研 究、疾病诊断、药物发现与开发等。


图1为已有的一种SPR时域调制相位检测原理示意图。图2为本发明实施的用于生物分子相互作用实时检测的表面等离子体共振干涉 成像系统的示意图。图3为本发明实施的C⑶结构的示意图。图4为本发明实施的检测及信号处理过程的流程图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例，对本发明的方法以及利用该方法实现的系统进行详细说 明。本发明的系统实施例结构如图2所示，由生物传感单元、入射臂、反射臂和信号采 集处理单元等四大部分组成。本发明所述的生物传感单元为表面等离子体共振生物传感 器，包括直角棱镜206、传感芯片208和置于传感芯片与棱镜之间的折射率匹配层207、传感 芯片208的玻璃基底的下表面镀有40nm厚的金膜209，以及位于传感芯片208下面的流体 池210，传感芯片208与流体池210紧贴且密封。本发明所述的入射臂位于生物传感单元的一侧，依次包括控温半导体激光器201、 单模光纤202、激光准直器203、偏振棱镜204和扩束镜205，扩束镜与直角棱镜206的入射 面平行。本发明所述的反射臂位于与入射臂相对应的生物传感单元的另一侧，依次包含二 分之一波片211、成像镜头212和偏振分束棱镜213，二分之一波片211与直角棱镜206的 出射面平行。本发明所述的信号采集处理单元包含CXD 214和CXD 215，以及用于图像采集和 数据处理的计算机，CXD 214和CXD 215分别接收经偏振分束棱镜213分成的两束光，图像 采集和数据处理的计算机分别与CXD 214和CXD 215的输出端相连。本实施例的各部件的具体实现及工作原理在本发明所述的入射臂中，控温半导体激光器201为DL-3148-025或其它型号，其 波长和功率分别为600-900nm和0. 5_10mW，在恒流电源的驱动下，发出光强稳定的激光，光 经格林透镜耦合到单模光纤202中，并在单模光纤202中传输一段距离再进入准直器203， 通过其后即成为光斑为3-10mm的准直光束。接着，又透过偏振棱镜204，成为线偏振光，其 偏振方向可调。最后，线偏振光通过扩束镜205，被扩束成直径为10-50mm的准直光束，直接 射到生物传感单元中。在本发明所述的生物传感单元中，棱镜206与传感芯片208的玻璃基底使用相同 的K9或ZF5玻璃，厚度为0. 8-3mm ；折射率匹配层207的折射率与棱镜206和传感芯片208 的玻璃基片折射率相同，折射率匹配层207为折射率油膜。传感芯片208的玻璃基片的一 面镀有30-50nm的金膜209，金膜209表面使用化学方法组装一层亲水的膜，用于偶联探针 分子。流体池210与金膜209紧贴且密封，金膜209的表面成为流体池的一面壁。当被检7测的生物分子溶液从流体池中流过时，溶液中被分析的生物分子与固定在金膜表面的探针 分子耦联即相互作用，引起金膜表面结构改变，随之对应的折射率发生变化。准直光束透过 棱镜206、折射率匹配层207和传感芯片208的玻璃基底，在玻璃基底和金膜209的界面发 生全反射。当入射角为共振角时，入射光的能量由倏逝波耦合到金膜209中，激发金膜表面 等离子体共振。由生物传感单元反射的光，通过反射臂上的二分之一波片211时，反射光的偏振 态得到调整，又经成像镜头212后将金膜表面成像，再经偏振分束棱镜213，光被分成传播 方向正交的2路，同时还分别产生干涉，2路干涉图像的相位差为180°，成像在所对应的 CXD 214或CXD 215的上，2台C⑶上的干涉图像为同一时刻金膜表面的实像。在本发明实施的信号采集处理单元中，计算机同时从CXD 214和CXD 215上采集 到相位差为180°的2帧干涉图像后，根据公式(1)进行实时处理，得到即时金膜表面上生 物分子相互作用时所对应的折射率分布信息图。本发明实施例的CXD工作过程如图3所示，包括图像传感器CXD芯片1和CXD芯 片2分别将投射在其上的干涉图像同时转换为电信号，再经A/D转换成数字信号。接着，这 2路数字信号先经FPGA，再通过接口芯片，传输到计算机中，进行处理或存盘。计算机可通 过接口芯片，将曝光时间、A/D芯片寄存器配置等参数传送给FPGA芯片，前者控制CXD芯片 的曝光信号的产生，后者配置A/D芯片。FPGA芯片可产生C⑶水平和垂直时钟，以及曝光和 帧同步信号，这些信号控制CCD驱动电路进行电压变换和功率放大，而后驱动CCD芯片。同 时，FPGA芯片不仅要产生A/D采样时钟来控制A/D模数转换，而且还要产生帧同步和像素 时钟信号，传送到接口芯片，控制同步采集过程。本实施例的检测及信号处理过程如图4所示。测量开始，由计算机同时读入CCD 芯片1和C⑶芯片2传感的相位差为180°的2帧干涉图像。紧接着，根据公式[1]，计算 机对2帧干涉图像进行处理，计算得到1张反映金膜表面即时折射率分布信息图。同时，也 可以根据需要选择金膜表面上感兴趣的传感点，确定该点的即时折射率，绘制对应的测量 曲线，便完成了一个操作周期。重复该过程，又可以得到1张新的反映金膜表面即时折射率 分布信息图，这张信息图相对前一张是变化了的，即与前一张的折射率分布不同。计算这2 张信息图之间的差异，便可得到该传感点上发生分子相互作用时引起的折射率变化。不断 重复进行，就可以实时检测生物分子相互作用的全过程，并绘出或打印出该传感点的折射 率随时间变化的曲线，提供给生物医学研究人员进行相关解析，以便为临床诊断、药物发现 及开发服务。
权利要求
1.一种用于生物分子相互作用实时检测的干涉成像方法，其特征在于，该方法是基于 表面等离子体共振阵列生物传感原理，将光源发出的光经准直再通过偏振棱镜，并经扩束 后射到传感单元中；从传感单元反射的光经二分之一波片、成像镜头和偏振分束棱镜后，分 成透射和反射2路光，该2路光的传播方向正交，且同时分别干涉成像在2台CXD上，2路 干涉图像的相位差为180° ；计算机实时从2台C⑶上采集到相位差为180°的2帧干涉图 像，通过解算该2帧干涉图像，得到1张反映即时金膜表面的折射率分布信息图；不断测量 传感单元中连续发生的反应，得到一系列折射率分布随时间变化的实时信息图。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤1)半导体激光器发出的光经过光纤耦合和准直后，再通过偏振器，得到偏振方向可调 的线偏振准直光束；2)所述的线偏振准直光束通过扩束镜后，入射到生物传感单元中的传感芯片的玻璃基 底与金膜之间的界面上，激发金膜上的表面等离子体共振，同时又从该界面反射；3)所述的反射光通过二分之一波片，该二分之一波片的快轴方向与S偏振方向成 22. 5°角，以便调整反射光的偏振状态，接着通过成像镜头，由成像镜头将金膜表面成像；4)通过成像镜头的光又射入偏振分束棱镜，经过偏振分束棱镜后被分成传播方向为 正交的2路偏振光，同时每路偏振光均产生干涉，2路偏振光所产生的干涉图像的相位差为 180°，分别投射在2台CXD上，即将干涉图像成像CXD上，2路偏振光的干涉图像都包含同 一金膜表面的折射率分布信息；5)计算机实时采集成像在2台CCD上的干涉图像，即相位差为180°的2帧图像，并进 行存储与处理；6)计算机利用采集到相位差为180°的2帧干涉图像，根据公式[1]A=ioil8G_ [！]I0+I180计算出这2帧干涉图像所反映的金膜表面折射率分布，即得到折射率分布信息图；式 中，Io为其中一帧干涉图像的灰度，I180为另一帧干涉图像的灰度；7)生物反应不断进行，计算机持续采集干涉图像，实时解算所采集到的干涉图像，便得 到一系列反映生物分子相互作用所对应的折射率变化信息图。
3.一种基于上述方法的用于生物分子相互作用实时检测的干涉成像系统，其特征在 于包括产生准直光的入射臂，接收准直光并激发表面等离子体共振的生物传感单元，将从 生物传感单元射出的光分成正交的2路偏振光且分别干涉成像的反射臂，以及包含获取干 涉图像的2台CCD和计算机的信号采集处理单元；所述入射臂中的偏振激光准直部分包括半导体激光器、依次设置在半导体激光器出 射光路中的单模光纤、激光准直器、偏振棱镜和扩束镜；所述生物传感单元包括接收从入射臂射出的光的直角或梯形棱镜，置于直角或梯形 棱镜底面的折射率匹配层，置于折射率匹配层下的传感芯片以及位于传感芯片下面的流体 池；该传感芯片由玻璃基底以及镀在该玻璃基底的下表面上的30-50nm厚的金膜，所述棱 镜、折射率匹配层和传感芯片玻璃基底的折射率相同；所述反射臂中包括设置在生物传感 单元出射光路中的二分之一波片、成像镜头和偏振分束棱镜，该二分之一波片的快轴方向 与S偏振方向成22. 5°角；所述信息采集处理单元包括2台CCD或CMOS以及与之相连的计算机；2台CCD的接收 面分别与从偏振分束棱镜正交射出的2路干涉偏振光垂直，且CCD位于成像透镜的焦面上。
4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述半导体激光器的波长为600-900nm；所 述入射臂中的扩束镜的扩束倍数为2-8倍。
5.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述的折射率匹配层为与棱镜及传感芯片 玻璃基底折射率相同的折射率油膜。
全文摘要
本发明涉及用于生物分子相互作用实时检测的干涉成像方法及其系统，属于生物技术领域；该方法包括光源发出的光经准直、偏振，并经扩束后射到传感单元中；从传感单元反射的光经二分之一波片、成像镜头和偏振分束棱镜后，分成传播方向正交的透射和反射2路光，且成像在2台CCD上；计算机实时采集2帧干涉图像，通过解算，得到1张折射率分布信息图；不断测量传感单元，得到一系列折射率分布随时间变化的实时信息图。该系统包括产生准直光的入射臂，接收准直光并激发表面等离子体共振的生物传感单元，以及采集处理单元；本发明能够高通量、高精度、实时、无标记检测蛋白质芯片，获取蛋白质分子之间以及蛋白质与其它生物分子相互作用的信息。
文档编号G01N21/45GK102042972SQ20101052378
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者余兴龙, 张玮, 王大千, 罗昭锋, 邓焱 申请人:清华大学