专利名称：同时检测磺胺类和喹诺酮类药物的elisa方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测磺胺类和喹诺酮类药物的ELISA方法及其试剂盒。
背景技术：
磺胺类药,英文名称为Sulfonamides,是通过人工合成的氨苯磺胺衍生物,主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。代表药物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉等。磺胺类药物一般为白色或淡黄色结晶性粉末，遇光易变质，颜色逐渐变深，大多数本类药物不易在水中溶解，但易溶于稀碱。形成钠盐后易溶于水， 其水溶液呈强碱性。磺胺类药物能抑制革兰氏阳性菌及一些阴性菌，可以治疗多种细菌感染，在兽医临床上广泛应用于治疗由敏感细菌感染的各种畜禽疾病。主要是通过干扰细菌的叶酸代谢而抑制细菌的生长繁殖。有些细菌生长时需要的一种“生长物质” 一对氨苯甲酸(PABA)，而磺胺类药的化学结构与氨基苯甲酸很像，它可以与氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，妨碍二氢叶酸的形成从而最终影响细菌核蛋白的合成，从而抑制细菌的生长繁殖。
由于磺胺类药物在体内的作用和代谢时间较长，通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体内蓄积。蓄积浓度超过一定值时，就会对人体造成损害。短时间大剂量或长时间小剂量的刺激可分别引起急性或慢性中毒，影响机体的泌尿、免疫系统，破坏肌肉、肾脏和甲状腺等组织，如诱发人的甲状腺癌等。另外，人体内长期存在磺胺会导致许多细菌对磺胺类药物产生抗药性。因此，国际食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，动物性食品中磺胺类总量的最大残留限量(MRL)为O. lmg/kg。
喹诺酮类(Quinolones, QNs),是一类人工合成的含4_喹诺酮基本结构，对细菌 DNA螺旋酶具有选择性抑制的抗生素。1962年最早的喹诺酮类药物萘啶酸首先用于临床， 由于其抗菌谱窄、口服吸收差、副作用高等原因现在已很少使用。当前应用的喹诺酮大多为含有氟原子的氟喹诺酮类。这类药物抗菌谱广，对革兰氏染色呈阴性杆菌活性较高，对其他抗生素耐药的细菌也具有良好的抗菌作用，无交叉耐药性；在体内分布广，体内和组织中药物浓度高；口服吸收好，半衰期长，使用方便；与头孢菌素类药物相比，抗菌作用相似，但价格便宜。目前在兽医临床上常用的药物主要有诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氟甲喹等十几种，随着应用的增加，其各种毒副作用也逐渐显现出来，主要体现在头晕、低血糖、恶心、胃肠道症状、中枢神经系统和过敏反应。特别是近几年，严重的不良反应发生率约为I. 6%-1. 8%，引起了全世界的关注。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对喹诺酮类药物在动物源性食品中残留制定了最大残留限量(MRL)。 我国农业部文件(农质发20093号文件)中规定了 2009年我国畜禽产品监测项目，禽肉中4种喹诺酮类药物残留是重要的监测项目之一。
现有的磺胺和喹诺酮药物的检测方法多为色谱法，这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查，且目前现有的快速检测产品存在一定的局限性，无法同时检测磺胺和喹诺酮类物质的残留。本检测方法简便、灵敏，可同时检测数十个甚至上百个样品，不需要昂贵的仪CN 102928597 A书明说2/17 页器设备和专业的分析人员，特别适合企业进行现场监测，易于推广。发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时检测磺胺药物和喹诺酮药物的酶联免疫试剂盒，包括包被原、检测抗体和酶标抗体；
所述包被原为磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物的混合物、
所述检测抗体为磺胺药物的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体的混合物；
所述酶标抗体为如下I)或2)的酶标记的抗抗体组合物
I)辣根过氧化物酶标记的抗所述磺胺药物的特异性抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗所述喹诺酮药物的特异性抗体的抗抗体；
2)辣根过氧化物酶标记的抗所述喹诺酮药物的特异性抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗所述磺胺药物的特异性抗体的抗抗体。
在上述试剂盒中，所述磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被于同一酶标板上，也可以分别独立包装，在使用时包被于同一酶标板上。
在上述试剂盒中，所述磺胺药物的特异性抗体和所述喹诺酮药物的特异性抗体混合包装于同一溶液中，也可以 分别独立包装，在使用时混合加入。
在上述试剂盒中，所述酶标记的抗抗体组合物混合包装于同一溶液中，也可以分别独立包装，在使用时混合加入。
在上述试剂盒中，所述磺胺药物的特异性抗体为所述磺胺药物的单克隆抗体；和 /或，所述喹诺酮药物的特异性抗体为所述喹诺酮药物的单克隆抗体。
在上述试剂盒中，所述磺胺药物的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 3393的磺胺类单克隆抗体杂交瘤细胞株SAs分泌产生，对磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶有交叉反应；
和/或，所述喹诺酮药物的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 3779的诺氟沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株QNs分泌产生，对诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星有交叉反应。
在上述试剂盒中，所述磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物为磺胺二甲基嘧啶半抗原与卵清蛋白的偶联物，所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物为诺氟沙星半抗原与卵清蛋白的偶联物。
在上述试剂盒中，还含有6种标准品溶液，所述6种标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，溶质为磺胺二甲基嘧啶和诺氟沙星；所述溶质在所述6种标准品溶液中的浓度分别为 O μ g/L 和 O μ g/L，O. 5 μ g/L 和 O. 3 μ g/L，I. 5 μ g/L 和 0· 9 μ g/L，4. 5 μ g/L 和 2· 7 μ g/L， 13. 5 μ g/L和8. I μ g/L, 40. 5 μ g/L和24. 3 μ g/L ;所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为O. 27g/ L、I. 13g/L、0. 2g/L 和 8. 8g/L，pH 值为 7· 4。
在上述试剂盒中，还可含有样品稀释液和/或样品提取液和/或浓缩洗涤液和/4或底物显色液和/或终止液；
所述样品稀释液为PBS缓冲液；
所述样品提取液的溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温20，所述溶质在所述样品提取液中的浓度为2mL/L ；
所述浓缩洗涤液的溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温20和叠氮化钠，所述溶质在所述浓缩洗涤液中的浓度分别为10mL/L和5g/L ；
所述底物显色液为独立包装的底物显色液A和独立包装的底物显色液B和/或独立包装的底物显色液C ;所述底物显色液A为2g/mL过氧化脲水溶液；所述底物显色液B为 lg/mL四甲基联苯胺水溶液；所述底物显色液C为O. 05mol/L对硝基磷酸苯酯水溶液；
所述终止液为独立包装的终止液A和/或独立包装的终止液B ;所述终止液A为 O. 2mol/L的磷酸氢二钠水溶液；所述终止液B为I. OmoI/L的硫酸水溶液。
本发明的另一个目的是提供一种同时检测样品中磺胺药物和喹诺酮药物的方法， 包括如下步骤
I)对样品进行前处理获得所述样品的溶液；
2 )用上述任一所述试剂盒进行检测；
3)分析检测结果。
在上述方法中，所述用试剂盒进行检测包括如下步骤向包被有所述磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物的酶标板中加入标准品溶液或所述样品的溶液；再加入含磺胺药物的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体的溶液；温育后洗涤拍干，加入所述酶标记抗抗体组合物，先用碱性磷酸酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值；再用辣根过氧化物酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值。
在上述方法中，所述对样品进行前处理根据样品的不同，前处理方法不同，具体如下
I)当所述样品为肉样或鸡蛋时，所述前处理包括将所述样品均质后与样品提取液混合离心后，取上清获得所述样品的溶液；所述混合的比例具体可为每克所述样品与20毫升所述样品提取液混合；
2)当所述样品为牛奶时，所述前处理包括将所述样品离心后的中间层液体与样品稀释液混合，获得所述样品的溶液；所述混合的比例具体可为每毫升所述中间层液体与4 毫升所述样品稀释液混合。
在上述方法中，所述样品提取液的溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温20，所述溶质在所述样品提取液中的浓度为2mL/L ；
所述样品稀释液为PBS缓冲液，溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为O. 27g/L、l. 13g/L、0. 2g/L和 8. 8g/L，pH 值为 7.4。
本发明试剂盒检测的原理一种可同时检测磺胺类和喹诺酮类药物的双色联合的间接竞争ELISA法，此法以磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物与喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物混合并包被酶标板，以磺胺药物单克隆抗体及喹诺酮药物单克隆抗体的混合液作为第一抗体，以标记有辣根过氧化物酶(HRP)的抗磺胺药物单克隆抗体的抗抗体及标记有碱性磷酸酶(AP)的抗喹诺酮药物单克隆抗体的抗抗体的混合液作为第二抗体，进行显色反应时首先加入AP的底物对硝基磷酸苯酯，用O. 2mol/L的Na2HPO4终止反应，并测 405nm处吸光度值，以检测喹诺酮类药物，而后用缓冲溶液洗酶标板I次,再加入HRP的底物四甲基联苯胺，以I. Omol/L H2SOJ*止反应，测450nm处吸光度值，以检测磺胺药物；也可以根据显色的深浅来判断样品中磺胺药物和喹诺酮药物的含量，如果样品中的游离磺胺药物和喹诺酮药物的量少，显色深，反之，则显色浅。以此种方法进行的磺胺药物和喹诺酮药物的检测，其结果互不干扰。
实验证明，本发明试剂盒可检出待测样品中的磺胺药物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧唳、磺胺间二甲氧嘧唳、磺胺间甲氧嘧唳、磺胺喹恶啉、磺胺嘧唳、磺胺甲氧哒嗪或磺胺对甲氧嘧啶，喹诺酮药物有诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星；可检测的样品包括猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉、虾肉、鸡蛋和牛奶，检测猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉和虾肉中磺胺药物的最低检测限为lng/g，鸡蛋为5ng/g，牛奶为5ng/mL ;检测猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉和虾肉中喹诺酮药物的最低检测限为lng/g,鸡蛋为2. 5ng/g,牛奶为5ng/mL,变异系数均小于20%,稳定性很好。本发明的试剂盒及方法可用于食品生产企业的自我质量控制，食品安全监督和检测机构的常规筛查，还可用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。
图I为实施例I试剂盒检测磺胺二甲基嘧啶含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中磺胺二甲基嘧啶浓度(μ g/L)，纵坐标为百分吸光度值(％)。
图2为实施例I试剂盒检测诺氟沙星含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶液中诺氟沙星浓度(μ g/U,纵坐标为百分吸光度值(％)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的药物购自Sigma-Aldrich。
下述实施例中如无特别说明，所用的PBS缓冲液组成如下溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为O. 27g/ L、I. 13g/L、0. 2g/L 和 8. 8g/L，pH 值为 7· 4。
实施例I、制备同时检测磺胺和喹诺酮药物的酶联免疫试剂盒
该试剂盒组成如下酶标板(同时包被磺胺药物与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物)、抗体工作液(含磺胺药物单克隆抗体和喹诺酮药物单克隆抗体)、酶标抗抗体工作液(含辣根过氧化物酶标记的抗磺胺药物单克隆抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗喹诺酮药物单克隆抗体的抗抗体)、浓缩洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度磺胺二甲基嘧啶和诺氟沙星的标准品溶液1-6、底物显色液Α、底物显色液B、底物显色液C、终止液A和终止液B。
制备方法如下
一、酶标板的制备
I、磺胺二甲基嘧啶(SM2)包被原的制备NH—OVA(式I)
2、诺氟沙星(NOR)包被原的制备
I)诺氟沙星(NOR)的哌嗪环仲氨基与4-溴丁酸乙酯结合来制备NOR半抗原将 320mg NOR与143yL 4-溴丁酸乙酯共溶于IOOmL 二甲基亚砜中，再加入700mg碳酸钾和 30mg碘化钠，70°C回流3天，再静置I天；然后加水400mL，用IOOmL 2X乙酸乙酯萃�。腿∠嗑吹�、无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸干，得浅黄色粘稠状液体。
酯的碱性水解在上述黄色粘稠状液体中加入IM氢氧化钠2mL，再加入500 μ L乙醇助溶，70°C反应8h (溶液由浑浊变为浅黄色澄清液体，说明水解成功)，用盐酸调节pH为 7左右。用氮气吹干上述溶液，冷冻干燥过夜，得到诺氟沙星半抗原，其结构式如式II所示。
以磺胺二甲基嘧啶(SM2)作为磺胺二甲基嘧啶半抗原。
I)取104mg磺胺二甲基嘧啶(SM2),加入8mL O. 25mol/L的硫酸水溶液中，置于4°C 冰箱，形成溶液I (含SM2);
2)取200mg的卵清蛋白(OVA)溶于8mL的Na2CO3溶液中(pH=10)，置于4°C冰箱， 形成溶液II (含0VA);
3 )取 38mg NaNO2 加入 2mL 水，得到溶液III (含 NaNO2)；
4)将溶液III(含NaNO2)缓慢加入到溶液I (含SMj*，在此过程中，溶液I (含SM2) 置于碎冰中，大概15min，得到溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)；
5)将溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)缓慢加入到溶液II (含0VA)的烧杯中，并摇动烧杯，此时有红色物生成；6min后，将烧杯置于磁力搅拌器上，室温慢速搅拌，继续加溶液 IV (含SM2-NaNO2混合物)；在搅拌过程中，检测pH值，使之保持在9_10之间，最终溶液变成暗红色液体；室温继续搅拌4h ;装入透析袋，生理盐水透析。得到磺胺二甲基嘧啶与卵清蛋白的偶联物，即为磺胺二甲基嘧啶(SM2)包被原，其结构式如式I所示。
权利要求
1.一种同时检测磺胺药物和喹诺酮药物的酶联免疫试剂盒，包括包被原、检测抗体和酶标抗体； 所述包被原为磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物的混合物； 所述检测抗体为磺胺药物的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体的混合物； 所述酶标抗体为如下I)或2)的酶标记的抗抗体组合物 1)辣根过氧化物酶标记的抗所述磺胺药物的特异性抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗所述喹诺酮药物的特异性抗体的抗抗体； 2)辣根过氧化物酶标记的抗所述喹诺酮药物的特异性抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗所述磺胺药物的特异性抗体的抗抗体。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有6种标准品溶液，所述6种标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，溶质为磺胺二甲基嘧啶和诺氟沙星；所述溶质在所述6种标准品溶液中的浓度分别为O μ g/L和O μ g/L, O. 5 μ g/L和O. 3 μ g/L, I. 5 μ g/L和0· 9 μ g/L, 4. 5 μ g/L 和 2· 7 μ g/L, 13. 5 μ g/L 和 8· I μ g/L, 40. 5 μ g/L 和 24. 3 μ g/L ;所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾和氯化钠，所述溶质在所述PBS缓冲液中的浓度分别为O. 27g/L、I. 13g/L、0. 2g/L和8. 8g/L，pH值为7. 4。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有样品稀释液和/或样品提取液和/或浓缩洗涤液和/或底物显色液和/或终止液； 所述样品稀释液为所述PBS缓冲液； 所述样品提取液的溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温20，所述溶质在所述样品提取液中的浓度为2mL/L ； 所述浓缩洗涤液的溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温20和叠氮化钠，所述溶质在所述浓缩洗涤液中的浓度分别为10mL/L和5g/L ； 所述底物显色液为独立包装的底物显色液A和独立包装的底物显色液B和/或独立包装的底物显色液C ;所述底物显色液A为2g/mL过氧化脲水溶液；所述底物显色液B为Ig/mL四甲基联苯胺水溶液；所述底物显色液C为O. 05mol/L对硝基磷酸苯酯水溶液； 所述终止液为独立包装的终止液A和/或独立包装的终止液B ;所述终止液A为O.2mol/L的磷酸氢二钠水溶液；所述终止液B为I. OmoI/L的硫酸水溶液。
4.一种同时检测样品中残留磺胺药物和喹诺酮药物的方法，包括如下步骤 1)对样品进行前处理； 2)用权利要求1-3中任一所述试剂盒进行检测； 3)分析检测结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述用试剂盒进行检测包括如下步骤向包被有所述磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物的酶标板中加入标准品溶液或所述样品的溶液；再加入磺胺药物的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体；温育后洗涤拍干，加入所述酶标记抗抗体组合物，先用碱性磷酸酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值；再用辣根过氧化物酶的底物显色、终止并用酶标仪测定吸光值。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测磺胺类和喹诺酮类药物的ELISA方法及其试剂盒。本发明所提供的试剂盒是以磺胺药物半抗原与载体蛋白的偶联物和喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原，以磺胺药物的特异性抗体和喹诺酮药物的特异性抗体的混合物为检测抗体，以辣根过氧化物酶酶标记的抗磺胺药物的特异性抗体的抗抗体和碱性磷酸酶标记的抗喹诺酮药物的特异性抗体的抗抗体为酶标二抗。本发明的方法是使用所述试剂盒并在显色时先用碱性磷酸酶的底物显色再用辣根过氧化物酶的底物显色，可一次同时检出磺胺和喹诺酮药物。本发明可用于食品生产企业的自我质量控制，食品安全监督和检测机构的常规筛查，还可用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。
文档编号G01N33/535GK102928597SQ20121042184
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者吴小平, 王世恩, 杨铮, 何丹婷, 苏丽芳, 李淑芳 申请人:北京维德维康生物技术有限公司
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