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专利名称：一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法
技术领域：
本发明涉及仪器分析领域，特别涉及一种非破坏性、在线测定固态生物质生 物转化过程中基质和产物含量的方法。
背景技术：
在生物质的转化过程中，生物转化由于其对环境的友好性而成为研究热点。 生物质的生物转化主要包括微生物发酵(主要是固态发酵)和酶解。传统的固态 发酵和现代固态发酵的底物基本上以农副产品为主，常用的发酵基质包括玉米秸 秆、小麦秸秆、水稻秸秆、麸皮、稻壳、玉米芯、玉米、小米、大豆、甘蔗渣、 木薯等。从来源分析，秸秆类生物质理所当然地是固态发酵的主要底物，尤其是 固态发酵生产的大宗产品，如燃料乙醇，生物柴油等。培养基的差异决定了发酵
过程众多参数的测定差异，许多参数的测定不能套用液体发酵方法，如生物量， 在液体发酵时只需离心过程就可将菌体从发酵液中分离出來，而固态发酵中生物
量的测定就相当麻烦。固态发酵的生物量测定一般采用间接的测定方法，比如氨 基葡萄糖法(路秀玲等，2000，天津轻工业学院学报，第4期，57-62页)，而 木质纤维素组分分析的方法(Standard Bio腿ss Analytical Procedures, National Renewable Energy Laboratory,
http:〃www. nrel. gov/biomass/analytical—procedures, html )需要用至伏量的 化学试剂，而且过程漫长，效率低下，难以实现在线测定。固态发酵和液态发酵 相比是一个比较粗放的过程，这是因为这个过程往往难以找到合适的过程监控方 式，因而也难以做到在线控制只能凭经验进行操作。生物质的酶解转化由于对于 生物质燃料的渴求而受到广泛的关注。其酶解过程的监测由于其过程中同时存在 固体和液体而很难用普通的分析方法进行快速检测，有着和固态发酵相同的需 求。
近红外光谱主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃 迁时产生的，记录的主要是含氢基团X-H (X-C、 N、 0)振动的倍频和合频吸收， 不同基团(如甲基、亚甲基，苯环等)或同一基团在不同化学环境中的近红外吸 收波长与强度都有明显差别，近红外光谱具有丰富的结构和组成信息，非常适合 用于碳氢有机物质的组成与性质测量。虽然NIR光谱的范围非�？恚�并且经常重 叠，但是它却具有很强的区别生物学相似原料的能力，比如咖啡的不同品种，不 同来源的奶粉和中草药。此外，近红外光纤漫反射探头可以用于少量样品的测量、 远程控制同时使整个操作过程更加方便。但是在固态发酵领域和生物质酶解过程 中尚无任何关于近红外的相关专利文献报道。
本发明的目的就是为了解决现有技术难以快速在线测定复杂固态基质成分 问题，充分利用近红外光谱中所包含的丰富信息，提供一种在线、快速、操作简 单、非破坏性测定不溶性生物质生物转化过程参数的方法。本发明所述一种快速 测定生物质生物转化过程参数的方法，其特征是，它包括如下步骤
(1) 选择有代表性的生物质生物转化过程，在转化过程中定时取样，获得 的样品作为建立多元回归预测模型的标准样品；
(2) 使用傅立叶变换近红外光谱仪和光导纤维探头测定标准样品集中每个 生物质生物转化样品的漫反射光谱；
(3) 釆用相应的化学或物理分析手段测定标准样品集中每个生物质生物转 化样品的过程参数，作为与样品集近红外光谱一一对应的化学值；
(4) 采用多元校正方法建立和优化多元回归预测模型，以校TH集样品的交 叉验证均方差(RMSEVC).为指标优化光谱预处理方法和模型参数，以对未知样品 的预测均方差'(RMSEP)考察模型的预测准确度，选取RMSECV和RMSEP尽可能小 的组合。RMSECV和RMSEP的计算公式如下<formula>formula see original document page 5</formula>
式中Ci是标准化学方法测得的值，C是NIR预测值，n是校正集样品数， m是验证集样品数。
(5)在生物转化过程中随时采集近红外图谱，将光谱输入预测模型，从而
发明内容通过模型在线确定生物转化过程的过程参数。
本发明和背景技术相比，具有的有益效果是
(1) 功能强，可实现生物质转化过程中多种参数的同时，在线测定。
(2) 使用方便，具有良好的移植性，当生物质转化工艺发生变化时，通过 增加回归预测模型的样品数量可以很方便的实现对新工艺的适用性。
(3) 具有良好的经济效益，传统的测量手段在取样、测定、数据分析等方 面要耗费大量的人力物力而且不能实现在线测量，而本方法很容易的 实现了在线测定。
具体实施例方式
实施例1用近红外光谱法快速测定固态发酵过程中培养基的含水量 本发明实施例的流程如下.
第一步建模样品集的制备，采用汽爆麦草和麦麸作为固态发酵的主要培养
基，调节培养基的在45_85%之间，培养基灭菌后接种绿色木霉在3(TC下在气相 双动态固态发酵反应器中进行固态发酵，培养到一定时间后，用作近红外多元回 归预测模型的校正集样品，取出发酵样品样品的数量在50份为好，样品集代 表性的好坏对预测模型的稳定性、适应性有很大影响。要求样品中含水量的标准 差大些为好。
第二步固态发酵样品的近红外光谱的测定。本实施例采用美国Nicolet公司 生产的Nexus型傅立叶变换近红外光谱仪，仪器参数设置为扫描谱区为 4000-10000cnT1 ，扫描次数为64次，分辨率为4 cm—'。样品近红外光谱的采集 通过光导纤维固体探头，以漫反射方式进行。每次扫描采用的设置要保持一致， 同时扫描期间不要移动或转动光纤探头。
第三步固态发酵样品的含水量的测定。取上述样品，准确称重，样品在105 。C烘干至恒重。准确称重，计算得样品的含水量，标准样品集中每一个样品的含 水量和所采集的近红外光谱一一对应。
'第四步预测数学模型的建立和优化。建立预测数学模型采用的多元校正方法 可以是偏最小二乘算法(PLS)、主成分回归法(PCR)、逆最小二乘法(ILS)、人 工神经网络法、支持向暈机和多元线性回归法(MLR)等。本实施例应用美国
Nicolet公司的TQAnalyst6. 2版本定量分析软件进行多元回归模型昨校正和优 化。将标准样品集中每个样品的近红外光谱和固态发酵样品的含水量的化学值一 一对应输入TQAnalyst6. 2定量分析软件。利用在软件中设置的自动寻找和优化 功能寻找建立模型的最佳条件，通过比较各种可能组合下预测模型的决定系数 (R2)，选取R2尽可能大的组合。采用内部交叉证实对预测数学模型进行验证。 内部交叉证实是指依次剔除建模样品集中一个(或多个)样品，用剩余样品来建 模预测被剔除样品的含量，比较被剔除样品预测值与化学值的差异，由此判断所 建模型的预测准确性，用交叉验证均方差(RMSEVC)考察，RMSEVC越�。�模型 预测准确性越高。最后通过预测均方差(RMSEP)考察模型的预测准确度。
本实施例获得建立固态发酵样品含水量多元回归预测模型的最佳条件为最 佳主成分维数为IO ，最佳谱区范围为8630-6880cm'，最佳光谱预处理方法为 不经过任何预处理。模型的多重相关系数(RS.Q)为0.994，交叉验证标准差 (RMSECV)为0. 00776。
第五步应用模型测定未知样品建立好预测数学模型之后，就可以测定未知固 态发酵过程中的含水量变化。重复第二歩采集未知样品的近红外光谱，将光谱输 入预测模型，计算机立即给出未知样品的含水量。用本实施例建立的模型测定 10个固态发酵样品的含水量，同时采用娱干法测定其含水量作为对比，预测值 和测定值用t检验检验后在0. 05的水平下无限制差别。
实施例2用近红外光谱法快速测定固态发酵过程中培养基的生物量
本发明实施例的流程如下
第一步建模样品集的制备，采用汽爆玉米秸秆和麦麸作为固态发酵的主要培
养基，调节培养基的含水量在75%左右，培养基灭菌后接种斜卧青霉在30C进行 固态发酵，培养到一定时间后，取出发酵样品，用作近红外多元回归预测模型的 校正集样品。样品的数量在50份为好。
第二步固态发酵样品的近红外光谱的测定。本实施例采用芙国Nicolet公司 生产的Nexus型傅立叶变换近红外光谱仪，仪器参数设置为扫描谱区为 4000-10000cm—1 ，扫描次数为64次，分辨率为4 cnf'。样品近红外光谱的采集 通过光导纤维固体探头，以漫反射方式进行。
第三步固态发酵样品的生物量的测定。取烘干的发酵样品0.50g，研碎后用10mll2NHCl浸泡24小时，样品中加入40ml蒸馏水在121。C下水解2小时，样品 过滤后定容到50. 0 ml，取10. 0 ml用NaOH中和到pH7. 0后定容到25. 0 ml，取 1. 0 ml，加入1 ml乙酰丙酮试剂在9CTC保温1小时，冷却后加入6 ml乙醇和1 mlEhrlich试剂在65'C保温IO分钟，冷却后在.530nm比色，根据标准曲线确定 氨基葡萄糖的含量。然后将这些数据换算成mg氨基葡萄糖/g湿样品。由于根据 这些数据，再加上单位菌体生物量所含有的氨基葡萄糖的含量就可以得到基质中 的生物量含量，所以在某种意义上解决了氨基葡萄糖的问题就解决了生物量的测 定问题。标准样品集中每一个样品的生物量和所采集的近红外光谱一一对应。
第四步预测数学模型的建立和优化。本实施例应用美国Nicolet公司的 TQAnalyst6.2版本定量分析软件进行多元回归模型的校正和优化，同样可采用 其他商业化的同类型定量分析软件来完成。
本实施例获得建立固态发酵样品生物量多元回归预测模型的最佳条件为最 佳主成分维数为9 ，最佳谱区范围为8630-6880cm-'，最佳光谱预处理方法为 一阶导数处理。模型的多重相关系数(RSQ)为0.999，交叉验证标准差(脂SECV) 为0.0331mg/g。
第五歩应用模型测定未知样品建立好预测数学模型之后，就可以测定未知固 态发酵样品的生物量。重复第二歩采集未知样品的近红外光谱，将光谱输入预测 模型，计算机立即给出未知样品的生物量。'用本实施例建立的模型测定10个固 态发酵样品的生物量，同时采用酸解比色法测定其生物量作为对比。预测值和测 定值用t检验检验后在0. 05的水平下无限制差别。
实施例3用近红外光谱法快速测定固态发酵过程中培养基的纤维素酶
本发明实施例的流程如下
第一步建模样品集的制备，采用汽爆玉米秸秆作为固态发酵的主要培养基，
调节培养基的含水量在75%左右，培养基灭菌后接种绿色木霉在30'C进行固态发 酵，培养到一定时间后，取出发酵样品，用作近红外多元回归预测模型的校正集 样品。样品的数量在50份为好。
第二步固态发酵样品的近红外光谱的测定。本实施例采用芙国Nicolet公司 生产的Nexus型傅立叶变换近红外光谱仪，仪器参数设置为扫描谱区为 4000-10000cnf1 ，扫描次数为64次，分辨率为4 cnT1。样品近红外光谱的采集
通过光导纤维固体探头，以漫反射方式进行。
第三步固态发酵样品的纤维素酶的测定。取一定量的固态发酵样品，准确称 重加入20倍的蒸馏水在室温下浸泡4小时提取纤维素酶。提取结束后离心，上 清液吸使一定倍数后用DNS法测定纤维素酶的滤纸酶活。标准样品集中每一个样 品的纤维素酶和所采集的近红外光谱一一对应。.
第四步预测数学模型的建立和优化。本实施例应用美国Nicolet公司的 TQAnalyst6.2版本定量分析软件进行多元回归模型的校正和优化，同样可采用 其他商业化的同类型定量分析软件来完成。
本实施例获得建立固态发酵样品纤维素酶多元回归预测模型的最佳条件为 最佳主成分维数为10 ，最佳谱区范围为8630-6880cnf'，最佳光谱预处理方法为 一阶导数处理加Noiris导数滤波处理。模型的多重相关系数(RSQ)为0.984， 交叉验证标准差(RMSECV)为1. 69FPA/g。
第五步应用模型测定未知样品建立好预测数学模型之后，就可以测定未知固 态发酵样品的纤维素酶含量。重复第二步采集未知样品的近红外光谱，将光谱输 入预测模型，计算机立即给出未知样品的纤维素酶含量。用本实施例建立的模型 测定10个固态发酵样品的纤维素酶，同时采用DNS法测定其纤维素酶作为对 比。预测值和测定值用t检验检验后在0. 05的水平下无限制差别。
实施例4用近红外光谱法快速测定酶解过程中纤维素的含量变化
本发明实施例的流程如下
第一步建模样品集的制备，采用汽爆玉米秸秆作为纤维素酶的酶解底物，调
节物料的pH为4.8，固液比为1:9，按照15IUFPA/g汽爆玉米秸秆的比例加入 纤维素酶，5(TC进行酶解，酶解到一定时间后，取出酶解样品，用作近红外多元 回归预测模型的校正集样品。样品的数量在50份为好。
第二步酶解样品的近红外光谱的测定。本实施例采用美国Nicolet公司生产 的Nexus型傅立叶变换近红外光谱仪，仪器参数设置为扫描谱区为 4000-lOOOOcnf1 ，扫描次数为64次，分辨率为4 cm—'。样品近红外光谱的采集 通过光导纤维固体探头，以漫反射方式进行。
第三步固态发酵样品的纤维素的测定。取一定量的酶解样品，准确称重，烘 干后用改进的滤袋法测定样品中的纤维素含量。标准样品集中每一个样品的纤维素酶和所采集的近红外光谱一一对应。
第四步预测数学模型的建立和优化。本实施例应用美国Nicolet公司的 TQAnalyst6. 2版本定量分析软件进行多元回归模型的校正和优化，同样可采用 其他商业化的同类型定量分析软件来完成。
本实施例获得建立固态发酵样品纤维素多元回归预测模型的最佳条件为最 佳主成分维数为9 ，最佳谱区范围为8630-428pcm—'，最佳光谱预处理方法为 一阶导数处理加Norris导数滤波处理。模型的多重相关系数(RSQ)为0. 994， 交叉验证标准差(RMSECV)为1.09 %。
第五步应用模型测定未知样品建立好预测数学模型之后，就可以测定未知酶 解样品的纤维素含量。重复第二步采集未知样品的近红外光谱，将光谱输入预测 模型，计算机立即给出未知样品的纤维素l量。用本实施例建立的模型测定10 个酶解样品的纤维素，同时采用改进的滤袋法测定其纤维素作为对比。预测值和 测定值用t检验检验后在0. 05的水平下无限制差别。
实施例5用近红外光谱法在线监测微生物油脂积累过程
本发明实施例的流程如下
第一步酶解样品的近红外光谱的采集。本实施例采用美国Nicolet公司生产 的Nexus型傅立叶变换近红外'光谱仪，仪器参数设置为扫描谱区为 4000-10000cm—1 ，扫描次数为64次，分辨率为4 cm—'。样品近红外光谱的采集 时直接将探头插入固态发酵反应器的料层通过光导纤维固体探头进行。
第二步固态发酵样品的微生物油脂的测定。取一定量的发酵样品，准确称重， 用石油醚将发酵样品中的油脂提出，定量。标准样品集中每一个样品的油脂含量 和所采集的近红外光谱一一对应。
第三步预测数学模型的建立和优化。本实施例应用美国Nicolet公司的 TQAnalyst6.2版本定量分析软件进行多元回归模型的校IH和优化，同样可采用 其他商业化的同类型定量分析软件来完成。
本实施例获得建立固态发酵样品油脂多元回归预测模型的最佳条件为最佳 主成分维数为10 ，最佳谱区范围为8630-4080cm—'，最佳光谱预处理方法为一 阶导数处理加Norris导数滤波处理。模型的多重相关系数(RSQ)为0. 974，交 叉验证标准差(RMSECV)为0. 0081g/g。第五步应用模型测定未知样品建立好预测数学模型之后，就可以测定新的发 酵过程中的微生物油脂含量。重复第一歩采集未知样品的近红外光谱，将光谱输 入预测模型，计算机立即给出未知样品的微生物油脂含量。用上述样品进行预测 时测定值与预测值间的预测误差(固SEP)为0.5618%，预测值与化学测定值间 的相关系数为0.9631。
权利要求
1、一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法，其基本步骤如下(1)选择有代表性的生物质生物转化过程中的样品作为建立多元回归预测模型的标准样品集；(2)使用傅立叶变换近红外光谱仪和光导纤维固体探头测定标准样品集中每个生物质生物转化样品的漫反射光谱；(3)采用相应的化学或物理方法测定标准样品集中每个生物质生物转化样品的过程参数值，作为与样品集近红外光谱一一对应的化学值；(4)将第二步得到的每个标准样品近红外光谱数据经过预处理，采用多元校正方法建立和优化多元回归预测模型，以校正集样品的交叉验证均方差(RMSEVC)为指标优化光谱预处理方法和模型参数，以对未知样品的预测均方差(RMSEP)考察模型的预测准确度，选取RMSECV和RMSEP尽可能小的组合，RMSECV和RMSEP的计算公式如下<maths id="math0001" num="0001" ><math><![CDATA[ <mrow><mi>RMSECV</mi><mo>=</mo><msqrt> <mfrac><mrow> <mi>&Sigma;</mi> <msup><mrow> <mo>(</mo> <msub><mover> <mi>C</mi> <mo>^</mo></mover><mn>1</mn> </msub> <mo>-</mo> <msub><mi>C</mi><mi>i</mi> </msub> <mo>)</mo></mrow><mn>2</mn> </msup></mrow><mrow> <mi>n</mi> <mo>-</mo> <mn>1</mn></mrow> </mfrac></msqrt> </mrow>]]></math> id="icf0001" file="A2008101182020002C1.tif" wi="43" he="13" top= "120" left = "35" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/></maths><maths id="math0002" num="0002" ><math><![CDATA[ <mrow><mi>RMSEP</mi><mo>=</mo><msqrt> <mfrac><mrow> <mi>&Sigma;</mi> <msup><mrow> <mo>(</mo> <msub><mover> <mi>C</mi> <mo>^</mo></mover><mn>1</mn> </msub> <mo>-</mo> <msub><mi>C</mi><mi>i</mi> </msub> <mo>)</mo></mrow><mn>2</mn> </msup></mrow><mi>m</mi> </mfrac></msqrt> </mrow>]]></math> id="icf0002" file="A2008101182020002C2.tif" wi="41" he="13" top= "120" left = "84" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/></maths>式中Ci是标准化学方法测得的值， id="icf0003" file="A2008101182020002C3.tif" wi="2" he="5" top= "137" left = "106" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>是NIR预测值，n是校正集样品数，m是验证集样品数(5)在生物转化过程中随时采集近红外图谱，将光谱输入预测模型，从而通过模型在线确定生物转化过程的过程参数。
2、 根据权利要求1所述的一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法， 其特征在于，所述的生物质包括未经处理或经过粉碎、挤压、汽爆、稀酸、热水、 碱液、射线、有机溶剂处理的玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、麸皮、稻壳、玉 米芯、玉米、小米、大豆、甘蔗渣、木薯或其中的组合。
3、 根据权利要求1所述的一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法， 其特征在于，所述的过程参数包括发酵底物中的营养成分的含量，如葡萄糖、氨 基酸、蛋白质、油脂等可供微生物用作碳源，氮源的有机成分，包括发酵底物的 含水量，包括发酵底物中的pH值，包括发酵底物中的生物量，间接测定生物量 的成分包括氨基葡萄糖、麦角甾醇，蛋白质、核酸和ATP等，包括发酵过程的各种有机产物，如酶、蛋白质、氨基酸、有机酸、抗生素和维生素等。
4、根据权利要求1所述的一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法， 其特征在于，所述的预处理包括平滑、中心化、归一化、 一阶或二阶导数处理。
5、 根据权利要求1所述的一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法， 其特征在于，所述的多元回归方法包括偏最小二乘算法、主成分回归法、逆最小 二乘法、多元线性回归法、人工神经网络法和支持向量机等。
6、 根据权利要求1所述的一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法， 其特征在于，所述的生物质生物转化过程包括固态发酵和木质纤维素原料酶解。
全文摘要
本发明涉及一种在线检测固态生物质生物转化过程的方法，其步骤为，选择不少于50份有代表性的生物质生物转化过程中的样品作为标准样品采集标准图谱；以其他手段获得目标过程参数；通过多元回归建立定量模型以定量其他未知过程。本发明只需建立一个预测模型即可实现对生物转化过程中的参数在线检测，无需样品制备，不消耗试剂，可实现对生物转化过程的自动检测和控制。本方法用于固态发酵含水量、生物量、油脂产量和纤维素酶的预测，预测相关系数分别达到了0.994，0.999，0.984和0.994。
文档编号G01N21/47GK101339186SQ20081011820
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者李宏强, 陈洪章 申请人:中国科学院过程工程研究所