专利名称：一种从鸡蛋中同时提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法
技术领域：
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林同时提取、净化和衍生化的方法。
背景技术：
在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检测，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。阿莫西林和氨苄西林均为白色或类白色结晶性粉末，味微苦，在水中微溶，在乙醇中几乎不溶。但是二者的钠盐或三水合物，在水中易溶，乙醇中略溶。国内外关于阿莫西林和氨苄西林的提取方法有许多报道。提取剂一般为磷酸二氢钾缓冲溶液、乙腈、甲醇水溶液等。到目前为止，国内外对鸡蛋中该两种药物同时提取、衍生的方法尚未见报道。
发明内容
为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取阿莫西林和氨苄西林的问题，本发明提供了一种同时提取、净化和衍生化的方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。本发明所采用的技术方案是一种同时从鸡蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法，是将鸡蛋制成勻浆后，加入乙腈振荡、混勻直接提�。胄模锨逡阂瞥觯馗刺崛�1-2次，合并上清液，即得提取液；
向提取液中加入经超纯水饱和的二氯甲烷，充分振荡、混勻、离心，经过此液-液萃取步骤，药物被转移至上层水相中，将上层水相移出，重复提取1-2次，合并水相。最后将水杨醛加入至萃取水相中，进行衍生化反应。其中水杨醛的添加量取决于样品中药物的含量，因为水杨醛只和样品中药物发生衍生化反应；通过大量实验，筛选出的水杨醛添加量25 μ L 必须是过饱和的，适合所有鸡蛋样品，但水相的量以1.0-1.5 mL为宜。上述方法中，乙腈为色谱纯级，添加量优选为样品量的4倍体积。二氯甲烷添加量与乙腈的添加量相等。采用本发明方法能将鸡蛋中的阿莫西林和氨苄西林同时提取出来，并经水杨醛衍生化步骤得到的溶液可以供HPLC检测用。本发明采用乙腈作为提取剂，两种药物的提取效率都很高，均达到77. 4%以上。此外，乙腈可有效去除蛋白质，再用二氯甲烷萃取可减少内源性杂质，有利于样品净化。本试验中通过对衍生化条件的优化，筛选出的最佳衍生化条件为25%三氯乙酸 200 μ L (为衍生化反应提供酸环境，在添加水相体积1. 0-1. 5mL的前提下筛选出三氯乙酸的浓度)、水杨醛25μ L、100°C水浴中加热60min
筛选出鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林残留的最佳前处理、衍生方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在77. 6%以上，日内和日间RSD均分别低于9. 6%和 14.8%,符合AOAC残留测定要求。
图1是衍生试剂色谱图2是鸡蛋空白对照样品色谱图 3 是 AMO (20ng · ml/1)和 AMP (20ng · ml/1)标准溶液色谱图(100 μ L 进样)； 图4是AMO (25ng · g"1)和AMP (25ng · g"1)空白鸡蛋添加色谱图(200 μ L进样)； 图5是口服给药样品色谱图。
具体实施例方式本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。1.实验鸡的饲养、给药和样品采集 1.1实验鸡选择及分组
选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡120只，体重1. 75士0. 20kg,随机分成4组，分别为阿莫西林试验组、氨苄西林试验组、阿莫西林和氨苄西林混合试验组、空白对照组，每组30只产蛋鸡。产蛋鸡均单笼饲养，给药前分别称重、编号。试验前预饲1周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。给药剂量、途径及样品采集
将阿莫西林原粉和氨苄西林原粉用无菌超纯水配成50 mg .mL-\90mg -πιΓ1的水溶液， 然后将药液分别用带有细乳胶管的注射器直接注入到鸡嗉囊中。各试验组产蛋鸡给药剂量见表1:
表1.各试验组产蛋鸡给药剂量
组别阿莫西林(AMO)组氨苄西林(AMP)组混合组对照组齐糧(mg/kg. b. w)2560AM025+AMP600. 0
试验组每天给药1次，给药时间均在上午8:00 9:00，连续5d，自给药日起至停药后
20d内，于每天17 30 18 00收集各试验组鸡蛋，分别做好标记，记录各试验组每天的产蛋数，每组每天可采集13 16个鸡蛋，鸡蛋样品保存在低温蛋库中。
2、本发明提取、萃取、净化及衍生化步骤
①用勻浆机将鸡蛋制成勻浆；
②准确称取5.0-6.0 g鸡蛋勻浆样品，放于30-50 mL具塞离心管中；③加入20-25mL乙腈溶液置漩涡混合器上混勻；
④漩涡振荡混勻2-;3min，8000-10000X g离心10_15min，温度设置为10_15°C ；
⑤上清液转移至另一50 mL具塞离心管中；
⑥加入20-25mL用超纯水饱和的二氯甲烷溶液置漩涡混合器上混勻(使药物溶于上层水相、乙腈溶于二氯甲烷溶液中)；
⑦漩涡振荡混勻2-;3min，6500-8000X g离心10_15min，温度设置为20_25°C ；
⑧取1.0-1. 5mL上层水相至10-15mL有刻度具塞的玻璃离心管中；
⑨向上述的玻璃离心管中分别加入200μ L25%的三氯乙酸溶液、25 μ L水杨醛(见图 1)，漩涡振荡混勻l-2min，将其放入沸水浴中，衍生反应持续60min ；
⑩反应后取出样品，冷却至室温，将样品转移到2mL离心管中，分别用200-400μ L 50%
4乙腈溶液洗涤IOmL玻璃离心管1-2次，并合并到2mL离心管中，最后用50%乙腈溶液定容至2mL刻度；
上机前以18000-20000 Xg离心15min，过0. 22 μ m滤膜，滤液供HPLC检测(见图2、 图3、图5)。.回收率的测定准确称取5.Og勻浆后的空白鸡蛋勻浆液，置于50mL聚丙烯离心管中，同时添加低、中、高三种浓度的标准工作液，使得空白蛋液中同时分别含有阿莫西林5. 0、25、125叫1_1和氨苄西林5.0、25、125 ng · ；每个添加量设6个平行，经上述样品的提取、净化和衍生化后，进样200 μ L作HPLC检测(见图4)。HPLC检测条件色谱柱为 C18，5ym，250_X4. 6mm;流动相为A为0. 01 mol · L—1的磷酸二氢钾溶液，用2M盐酸调 pH至5.5 ;B是色谱纯级乙腈溶液；荧光检测器，激发波长354匪，发射波长445 nm ；柱温 35、0°C ；梯度洗脱程序见表2。根据峰面积计算添加回收率。本发明方法提取鸡蛋中AMO 和AMP的添加回收率及变异系数的结果见表3。表2.梯度洗脱程序
序号时间(min)流速(mL · mi if1)A 液(1 )B 液(%)梯度曲线形状101. 06535线性梯度曲线2101. 06535线性梯度曲线3111. 04060线性梯度曲线4181. 04060线性梯度曲线5191. 06535线性梯度曲线6221. 06535线性梯度曲线
表3鸡蛋中AMO和AMP的添加回收率及变异系数(n=6)
Itt*mmm β * Af-f"1 /Im^m I 日 1%_纖 Λ MΛAM) AM1C *3f| C* a tw. a 25 m,4 m 霧-4 S 77. β as m§ us1 SL S s.t as W.. I. I fi_6 ft,3 t.3 1.4 i i 後7 I "14.8 ILi IL 8.1 IiS IL 44.精密度的测定
日内精密度测定将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到量较多的含低、中、高3种药物浓度的样品。在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台 HPLC 6次重复测定低、中、高3种药物浓度的样品，求得日内(批内)精密度。日间精密度测定将检测回收率剩余的样品按药物浓度高低分别混合成3份，得到量较多的含低、中、高3种药物浓度的样品。在一周内不同日用不同的标准曲线及同一台 HPLC 6次重复测定低、中、高3种药物浓度的样品，求得日间(批间)精密度。
权利要求
1.一种同时从鸡蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法，是将鸡蛋制成勻浆后，加入乙腈振荡、混勻直接提取，离心，将上清液移出，重复提取1-2次，合并上清液，即得提取液；向提取液中加入经超纯水饱和的二氯甲烷，充分振荡、混勻、离心，将上层水相移出，重复提取1-2次，合并水相；最后将水杨醛加入至萃取水相中，进行衍生化反应。
2.根据权利要求1所述的同时从鸡蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法，其特征在于所述乙腈用量为样品量的4倍体积，二氯甲烷用量与乙腈的用量相等。
3.根据权利要求1或2所述的同时从鸡蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法，其特征在于所述的衍生化反应的条件为25%三氯乙酸200 μ L、水杨醛25 μ L、100°C水浴中加热60min。
全文摘要
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林同时提取、净化和衍生化的方法。该方法是将鸡蛋制成匀浆后，加入乙腈振荡、混匀直接提�。胄模锨逡阂瞥觯馗刺崛�1-2次，合并上清液，即得提取液；向提取液中加入经超纯水饱和的二氯甲烷，充分振荡、混匀、离心，将上层水相移出，重复提取1-2次，合并水相；最后将水杨醛加入至萃取水相中，进行衍生化反应。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在77.6％以上，日内和日间RSD均分别低于9.6％和14.8％，符合AOAC残留测定要求。
文档编号G01N1/28GK102323121SQ201110175198
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者孙瑛瑛, 张小杰, 徐东, 戴国俊, 王金玉, 谢恺舟, 谢星, 贾龙飞, 郭辉生, 陈国宏, 陈学森, 黄玉萍 申请人:扬州大学
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