亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白ngal的纳米材料检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术应用领域，具体地说是一种纳米材料检测试纸条及其制备方法。
背景技术：
NGALCNeutrophiL GeLatinase Associated LipocaLin)的分子量 22KD、也有报告25KD，主要存在于中性类细胞内，其他组织中存量很少。各种原因(创伤、中毒、感染、疾病)
导致急性和慢性肾损伤时，肾脏组织NGAL量明显升高释放入血液。检测血和/或尿NGAL是判断和评估急性和慢性肾损伤的生物标志物，是肾实质结构损伤的指标。类似诊断急性心肌梗死损伤的金标准心肌肌钙蛋白I、T。目前临床诊断急性和慢性肾损伤(功能不全)主要是检测血肌酐(creatine)，尿素氮、尿微量蛋白，均为肾损伤的间接功能指标。急性肾损伤后，2-3天血肌酐方出现。NGAL在急性肾损伤2-3小时后在血和尿中就明显升高，检测NGAL提前和极大提高了诊断肾实质损伤的能力的时间，对合理诊治，降低死亡率提供了客观依据。美国医院住院病人中急性肾损伤肾功能损伤患者约占总数5_7%，在医院重症病房(ICM)病人中比例高达25%，死亡率高达50-80%。急性和慢性肾损伤涉及心脏手术、化疗和放疗、重症高血压、糖尿病、败血症、心力衰竭、以及各种类型心肾综合征。该类病在美国麻省23家医院急性肾损伤(AKI)年花费保守估计80亿美元。因此，应用本申请专利检测NGAL将发挥巨大的社会和经济效益。

发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，专门用于检测人尿液或血液中的NGAL，其具有操作简便、灵敏度高，检测0.01-0. Ing/mL较传统方法敏感性提高1000倍、结果稳定等优点。本发明解决的另一个技术问题是提供一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体，在纳米材料垫上设有金包银纳米金壳复合物。优选地，其中金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将40-60nm、10_20nm纳米金包银壳标记物相联的复合物。优选地，其中特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQID NO:3 或 SEQ ID NO:4。优选地，其中金包银纳米金壳复合物中包含有显色抗体鼠抗人NGAL抗体B0T05，检测线抗体中包含有抗人NGAL单克隆抗体也称为捕捉抗体B0T06，所述质控线抗体为羊抗鼠 IgG0优选地，其中特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA 3’端标有生物素，特定单链DNA5 ’端连有巯基(-SH)。优选地，其中显色抗体与捕捉抗体为两株可互相配对形成夹心的抗人NGAL单克隆抗体。优选地，所述纳米材料垫为聚酯纤维膜制成的垫。优选地，其中样品垫为玻璃纤维膜制成的垫。 本发明的另一个技术方案为高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)纳米金壳溶液的制备；
(2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料(40-60nm和10_20nm)尺寸和纯度确定；
(3)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体B0T05与10-20nm和40_60nm金包银壳标记物相联的复合物；
用0. IM K2C03调节PH8. 5-9. 0 ;将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为4:100(U g/ml) +将单链DNA3’端标有生物素的30_80bpSSDNA与纳米壳信号抗体价链联接反应6-8小时，25 0C，其终浓度为0. 5-2. OuM；
将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 2-1. 0%，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4 ;
将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 PM)在25 °C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用；
(4)金壳纳米材料垫制备；
(5)硝酸纤维素膜预处理和备用；
(6)制备和组装金壳纳米材料垫；
(7)检测线制备；
(8)质控线制备；
(9)试纸条装配；
(10)检测。其中，步骤(3)中单链DNA长度为43bp，所述将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5。有益效果本发明使用多种尺寸中空的金纳米壳代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿NGAL检测，特异性高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。而且由于中空金壳的重量轻于同样大小的实心纳米金颗粒，其免疫层析的速度加快，有利于试纸的快速检测。应用特定条件下纳米粒子与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，增强检测信号达1000倍。结果易观察，灵敏度达到10pg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于各种原因导致的急性肾损伤的早期诊断，慢性肾功能不全透析及治疗效果评判。尤其适宜在广大基层医院推广和应用。


图I为本发明最佳实施例的整体结构示意 I、样品垫 2、纳米材料垫功能化IOnm金壳、信号抗体B0T05、功能化50nm信号抗体B0T05 3、硝酸纤维素膜4、吸收垫 5、检测线抗体 6、质控线抗体
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本实验用到的材料
检测线抗体为抗人NGAL单克隆抗体B0T06为捕捉抗体，质控线抗体为羊抗鼠IgG，金壳标记抗体包含有显色抗体为鼠抗人NGAL抗体B0T05，购买于Genscript The Biology CRO南京公司。金包银纳米金壳复合物所用到的特定单链DNA是由本公司设计合成制得。其他材料均自市场上购买。实施例I
如图I所示，一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫I、纳米材料垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6，在纳米材料垫2上设有金包银纳米金壳复合物。其中，金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将40-60nm和10_20nm纳米金包银壳标记物相联的复合物。其中，特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: I或SEQ IDNO:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4。其中，金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将50nm和IOnm纳米金包银壳标记物相联的复合物。其中金包银纳米金壳复合物中包含有显色抗体鼠抗人NGAL抗体BT05，检测线抗体中包含有抗人NGAL单克隆抗体也称为捕捉抗体BT06，所述质控线抗体为羊抗鼠IgG。所述特定单链DNA长度为30_80bp，特定单链DNA3’端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基(-SH)。显色抗体与捕捉抗体为两株可互相配对形成夹心的抗人NGAL单克隆抗体。所述纳米材料垫为聚酯纤维膜制成的垫。所述样品垫为玻璃纤维膜制成的垫。实施例2
(I)纳米金壳溶液的制备
以柠檬酸钠和鞣酸为双稳定剂和还原剂，制备单分散的，尺寸可调的准球形银纳米颗粒溶液。在50-70°C的水浴下，将I. 5-2. Oml的l%(AgN03溶液加入到50_70ml去离子水中，并加热至恒温。该溶液体系记为A ;在50-70°C的水浴下，将0. 05-5. Oml的0. 5%的鞣酸溶液和l-3ml的1%的柠檬酸钠溶液加入到20-40ml的去离子水中，并加热到恒温，该溶液记为B。在剧烈搅拌下，将B导入A中，并持续搅拌到溶液呈现亮黄色，此后将反应溶液加热到沸腾，并保持回流，持续10-30分钟，室温冷却后定容到100ml。以单分散的银纳米颗粒为牺牲模版，通过置换反应制备但分散的金纳米壳溶液取20-40ml银纳米颗粒溶液，在12000-15000g，4°C下离心15-30分钟，吸出上清液，再以去离子水重新分散，并定容到100ml。将此IOOml的银纳米颗粒溶液迅速加热到沸腾，在保持回流和剧烈搅拌下加入2mM HAuCl4 (或NaAuCl4/KAuCl4) l_4ml，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，之后在继续搅拌的情况下室温冷却。(2)显色抗体的金标记
用0. 05-0. 20MK2C03调节纳米金壳 溶液至pH为7. 4-9. O。于80_120ml纳米金壳溶液中逐滴加入显色抗体(鼠抗人NGAL抗体B0T05 ) 2. 0-4. Omg,搅拌3_10分钟)，静置20-60 分钟。再加入 15-35ml，2-10% BSA 和 20mM Tris_HClpH7. 5-9. 0，2-8 °C 封闭过夜，得反应液；反应液于2-8°C，3000-5000g，离心20-40分钟，沉淀用100_150ml，0. 5_2%BSA和20mM Tris-HClpH8. 0-9. 0重悬，重复离心两次，离心速度依次为4000_2000g和3000-1000g 得沉淀。用 1000-1500 ill 重悬液(成份为 20-40% 海藻糖，0. 5-2. 0% BSA,
0.005-0. 02%Tween-20,0. 01-0. 03% NaN3, 10-30mMTris-HCl,pH8. 0-9. 0)悬浮沉淀，得金标抗体；
(3)纳米材料垫制备及喷垫
膜处理液配制0. 15-0. 35%Triton X-100，0. 10-0. 20mMNaCl,0. 01-0. ImM)TrispH7. 5 ;聚酯纤维膜在膜处理液中浸泡(l_2h)，真空干燥；以I. 5-3. 0 yl/cm，将金标抗体喷印在纳米材料垫上；
(4)检测线制备
取I株抗人NGAL单克隆抗体B0T06 (可与鼠抗人NGAL抗体B0T05配对形成夹心)做检测线抗体，以缓冲液5-20%海藻糖，3-8%甲醇稀释为0. 5-2. Omg/mL ;用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为I U 1/cm形成检测线，真空干燥；
(5)质控线制备
羊抗鼠IgG用缓冲液5-20%海藻糖，3-8%甲醇稀释为0. 2-1. Omg/ml ;用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为0. 5ia/cm形成质控线，真空干燥；
(6)试纸条装配
将样品垫I、纳米材料垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6 ;切割粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存；
(7)检测
将样品滴加入加样孔，10-20分钟时观察，判读试纸条检测结果的标准为阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失效，质控线处无显色条带。实施例3
(I)纳米金壳溶液的制备
以柠檬酸钠和鞣酸为双稳定剂和还原剂，制备单分散的，尺寸可调的准球形银纳米颗粒溶液。在50-70°C的水浴下，将I. 5-2. Oml的l%(AgN03溶液加入到50_70ml去离子水中，并加热至恒温。该溶液体系记为A ;在50-70°C的水浴下，将0. 05-5. Oml的0. 5%的鞣酸溶液和l-3ml的1%的柠檬酸钠溶液加入到20-40ml的去离子水中，并加热到恒温，该溶液记为B。在剧烈搅拌下，将B导入A中，并持续搅拌到溶液呈现亮黄色，此后将反应溶液加热到沸腾，并保持回流，持续10-30分钟，室温冷却后定容到100ml。
以单分散的银纳米颗粒为牺牲模版，通过置换反应制备但分散的金纳米壳溶液取20-40mL银纳米颗粒溶液，在12000-15000g，4°C下离心15-30分钟，吸出上清液，再以去离子水重新分散，并定容到100ml。将此IOOml的银纳米颗粒溶液迅速加热到沸腾，在保持回流和剧烈搅拌下加入2mM HAuCl4 (或NaAuCl4/KAuCl4) l_4ml，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，之后在继续搅拌的情况下室温冷却。(2)显色抗体的金标记
用0. 05-0. 20MK2C03调节纳米金壳溶液至pH为7. 4-9. O。于80_120ml纳米金壳溶液中逐滴加入显色抗体(鼠抗人NGAL抗体B0T05) 2. 0-4. Omg,搅拌3_10分钟，静置20-60 分钟。再加入 15-35ml，2-10% BSA 和 20mM Tris_HClpH7. 5-9. 0，2-8 °C 封闭过夜，得反应液；反应液于2-8°C，3000-5000g，离心20-40分钟，沉淀用100_150ml，0. 5_2%BSA 和20mM Tris-HCLpH8. 0-9. 0重悬，重复离心两次，离心速度依次为4000_2000g和3000-1000g 得沉淀。用 1000-1500 ill 重悬液(成份为 20-40% 海藻糖，0. 5-2. 0% BSA,
0.005-0. 02%Tween-20,0. 01-0. 03% NaN3, 10-30mMTris-HCl,pH8. 0-9. 0)悬浮沉淀，得金标抗体；
(3)信号抗体B0T05与5-15nm和40_60nm金包银纳米金壳复合物的制备
用 0. IM K2CO3 调节 PH8. 5-9. 0 ；
将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为为4:100 ( u g/mL)；
将单链DNA3’端标有生物素的(43BP(30-80BP)) SSDNA与纳米壳金标抗体价链联接反应6-8小时，250C，其终浓度为0. 5-2. OuM0 将SSDNA与纳米壳金标抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5% (0. 2-1. 0%)，2MNaCl/20mMphosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4。将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 M)在25°C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用。清洗和保存液冲的组成及PH PH7. 4,0. 1%BSA、0. l%Tween20、IOmM phosphatesodium。(4)金壳纳米材料垫制备 纳米材料信号抗体复合物见(3)；
玻纤膜预处理及备用
硼酸缓冲液PH7. 4、IOmM硼酸，0. 5%蔗糖、1%BSA、0. 5Tween20、0. 05%叠氮钠玻纤膜(poLyecterfiter)浸泡于硼酸缓冲液2小时，其间换两次缓冲液，在50°C烘干2小时。玻纤膜与功能化信号抗体结合预处理后的玻纤膜浸泡于0. 05%蔗糖叠氮钠液中I小时，50°C烘干2小时。金包银壳抗体B0T05加于玻纤膜功能化B0T05标记连亲和素-辣根过氧化酶的B0T05,滴润玻纤膜，37°C干燥30分钟，干燥保存备用。(5)硝酸纤维素膜预处理和备用
PBS 缓冲液 PH7. 4、10mMPBS、3%BSA、0. 5%Tween20 ；
硝酸纤维素膜浸泡于PBS缓冲液4小时，50°C干燥2小时备用。(6)制备和组装金壳纳米材料
组装成分样品垫，纳米材料垫，功能化IOnm金壳，信号抗体B0T05、功能化50nm信号抗体B0T05，硝酸纤维素膜(捕捉抗体B0T06和羊抗鼠IgG抗体划线)和吸收垫6种成份。组装后完整膜37°C干燥，存储备用。(7)金壳纳米材料垫制备及喷垫
膜处理液配制0. 15-0. 35%Triton X-100, 0.10-0. 20mMNaCl,0. 01-0. ImM)TrispH7. 5 ;聚酯纤维膜在膜处理液中浸泡(l_2h)，真空干燥；以I. 5-3. 0 yl/cm，将金标抗体喷印在金壳纳米材料垫上；
(8)检测线制备
取I株抗人NGAL单克隆抗体B0T06 (可与鼠抗人NGAL抗体B0T05配对形成夹心)做检测线抗体，以缓冲液5-20%海藻糖，3-8%甲醇稀释为0. 5-2. Omg/ml ;用划膜仪将抗体划在 硝酸纤维素膜上，浓度为I U 1/cm形成检测线，真空干燥；
(9)质控线制备
羊抗鼠IgG用缓冲液5-20%海藻糖，3-8%甲醇稀释为0. 2-1. Omg/ml ;用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为0. 5ia/cm形成质控线，真空干燥；
(10)试纸条装配
将样品垫I、纳米材料垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6 ;切割粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存；
(11)检测
将样品滴加入加样孔，10-20分钟时观察，判读试纸条检测结果的标准为阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失效，质控线处无显色条带。实施例4
将100 Ii L配制的10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml NGAL标准品样品滴加入样品孔，15min观察结果,检测结果40ng/ml的参考品5min内检测线位置出现条带；20ng/ml的参考品IOmin内检测线位置出现条带；10ng/ml的参考品15min内检测线位置出现条带；5ng/ml的参考品30min内检测线不出现位置处。实施例5
I、金壳纳米材料垫制备
信号抗体B0T05与IOnm和50nm金包银纳米金壳复合物的制备
用 0. IM K2CO3 调节 PH8. 5-9. 0 ；
将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为为4:100 ( u g/ml)；
将单链DNA3’端标有生物素的30-80BP SSDNA与纳米壳金标抗体价链联接反应6_8小时，25°C，其终浓度为0. 5-2. OuM0将SSDNA与纳米壳金标抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5% (0. 2-1. 0%)，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4。将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 M)在25°C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用。清洗和保存液冲的组成及PH PH7. 4、0. 1%BSA、0. l%Tween20> IOmM phosphatesodium。
玻纤膜预处理及备用
硼酸缓冲液PH7. 4、IOmM硼酸，0. 5%蔗糖、1%BSA、0. 5Tween20、0. 05%叠氮钠玻纤膜浸泡于硼酸缓冲液2小时，其间换两次缓冲液，在50°C烘干2小时。玻纤膜与功能化信号抗体结合预处理后的玻纤膜浸泡于0. 05%蔗糖叠氮钠液中I小时，50°C烘干2小时。金包银壳抗体B0T05加于玻纤膜功能化B0T05标记连亲和素-辣根过氧化酶的B0T05,滴润玻纤膜，37°C干燥30分钟，干燥保存备用。2、硝酸纤维素膜预处理和备用
PBS 缓冲液 PH7. 4、10mMPBS、3%BSA、0. 5%Tween20 ；· 硝酸纤维素膜浸泡于PBS缓冲液4小时，50°C干燥2小时备用。3、制备和组装金壳纳米材料
组装成分样品垫，纳米材料垫，功能化IOnm金壳，信号抗体B0T05、功能化50nm信号抗体B0T05，硝酸纤维素膜(捕捉抗体B0T06和羊抗鼠IgG抗体划线)和吸收垫6种成份。组装后完整膜37°C干燥，存储备用。实施例6
I、金壳纳米材料垫制备
信号抗体B0T05与20nm和40nm金包银纳米金壳复合物的制备
用0. IM K2CO3调节PH8. 5-9. 0 JfNGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为为4:100(U g/ml)；将单链DNA3’端标有生物素的30-80BP SSDNA与纳米壳金标抗体价链联接反应6-8小时，250C，其终浓度为0. 5-2. OuM0将SSDNA与纳米壳金标抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5% (0. 2-1. 0%)，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4。将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 M)在25°C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用。清洗和保存液冲的组成及PH PH7. 4、0. 1%BSA、0. l%Tween20> IOmM phosphatesodium。玻纤膜预处理及备用
硼酸缓冲液PH7. 4、IOmM硼酸，0. 5%蔗糖、1%BSA、0. 5Tween20、0. 05%叠氮钠玻纤膜浸泡于硼酸缓冲液2小时，其间换两次缓冲液，在50°C烘干2小时。玻纤膜与功能化信号抗体结合预处理后的玻纤膜浸泡于0. 05%蔗糖叠氮钠液中I小时，50°C烘干2小时。金包银壳抗体B0T05加于玻纤膜功能化B0T05标记连亲和素-辣根过氧化酶的B0T05,滴润玻纤膜，37°C干燥30分钟，干燥保存备用。2、硝酸纤维素膜预处理和备用
PBS 缓冲液 PH7. 4、10mMPBS、3%BSA、0. 5%Tween20 ；
硝酸纤维素膜浸泡于PBS缓冲液4小时，50°C干燥2小时备用。3、制备和组装金壳纳米材料
组装成分样品垫，纳米材料垫，功能化20nm金壳，信号抗体B0T05、功能化40nm信号抗体B0T05，硝酸纤维素膜(捕捉抗体B0T06和羊抗鼠IgG抗体划线)和吸收垫6种成份。
组装后完整膜37°C干燥，存储备用。实施例7
I、金壳纳米材料垫制备
信号抗体B0T05与15nm和45nm金包银纳米金壳复合物的制备
用 0. IM K2CO3 调节 PH8. 5-9. 0 ；
将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为为4:100 ( u g/ml)；
将单链DNA3’端标有生物素的30-80BP SSDNA与纳米壳金标抗体价链联接反应6_8 小时，25°C，其终浓度为0. 5-2. OuM0将SSDNA与纳米壳金标抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5% (0. 2-1. 0%)，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4。将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 M)在25°C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用。清洗和保存液冲的组成及PH PH7. 4、0. 1%BSA、0. l%Tween20> IOmM phosphatesodium。玻纤膜预处理及备用
硼酸缓冲液PH7. 4、IOmM硼酸，0. 5%蔗糖、1%BSA、0. 5Tween20、0. 05%叠氮钠玻纤膜(poLyecterfiter)浸泡于硼酸缓冲液2小时，其间换两次缓冲液，在50°C烘干2小时。玻纤膜与功能化信号抗体结合预处理后的玻纤膜浸泡于0. 05%蔗糖叠氮钠液中I小时，50°C烘干2小时。金包银壳抗体B0T05加于玻纤膜功能化B0T05标记连亲和素-辣根过氧化酶的B0T05,滴润玻纤膜，37°C干燥30分钟，干燥保存备用。2、硝酸纤维素膜预处理和备用
PBS 缓冲液 PH7. 4、10mMPBS、3%BSA、0. 5%Tween20 ；
硝酸纤维素膜浸泡于PBS缓冲液4小时，50°C干燥2小时备用。3、制备和组装金壳纳米材料
组装成分样品垫，纳米材料垫，功能化15nm金壳，信号抗体B0T05、功能化45nm信号抗体B0T05，硝酸纤维素膜(捕捉抗体B0T06和羊抗鼠IgG抗体划线)和吸收垫6种成份。组装后完整膜37°C干燥，存储备用。
权利要求
1.一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于包括设在固定板上依次相连的样品垫(I )，纳米材料垫(2)，硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，在硝酸纤维素膜(3)上设有检测线抗体(5)和质控线抗体(6)，在纳米材料垫(2)上设有金包银纳米金壳复合物。
2.根据权利要求I所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将40-60nm和10-20nm纳米金包银壳标记物相联的复合物。
3.根据权利要求2所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: I或SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求2所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将50nm和IOnm纳米金包银壳标记物相联的复合物。
5.根据权利要求1-3所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述金包银纳米金壳复合物中包含有显色抗体鼠抗人NGAL抗体B0T05，检测线抗体(5)中包含有抗人NGAL单克隆抗体也称为捕捉抗体B0T06，所述质控线抗体(6)为羊抗鼠IgG。
6.根据权利要求3所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA 3’端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基(-SH)。
7.根据权利要求4所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于显色抗体与捕捉抗体为两株可互相配对形成夹心的抗人NGAL单克隆抗体。
8.根据权利要求I所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于所述纳米材料垫(2)为聚酯纤维膜制成的垫，所述样品垫(I)为玻璃纤维膜制成的垫。
9.一种如权利要求I所述的高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)纳米金壳溶液的制备； (2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料(40-60nm和10_20nm)尺寸和纯度确定； (3)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体B0T05与10-20nm和40_60nm金包银壳标记物相联的复合物； 用O. IM K2CO3调节PH8. 5-9. O ;将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为4:100(μ g/ml);将单链DNA3’端标有生物素的30_80bpSSDNA与纳米壳信号抗体价链联接反应6-8小时，250C，其终浓度为O. 5-2. O μ M ; 将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为O. 2-1. 0%，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4 ; 将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度O. 4 μ M)在25°C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用；(4)金壳纳米材料垫制备； (5)硝酸纤维素膜预处理和备用； (6)制备和组装金壳纳米材料垫； (7)检测线制备； (8)质控线制备； (9)试纸条装配； (10)检测。·
10.根据权利要求2所述一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中单链DNA长度为43bp，所述将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为O. 5%。
全文摘要
本发明公开了一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体，在纳米材料垫上设有金包银纳米金壳复合物。本发明还公开了一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，本发明应用于检测人血和/或尿NGAL，早期诊断急、慢性肾损伤特异性高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好分辨光信号，其免疫层析的速度加快，有利于试纸的快速检测，增强检测信号达1000倍。结果易观察，灵敏度达到10pg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。
文档编号G01N33/68GK102955036SQ201210489700
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者张寄南, 鲁翔, 杨俊伟, 郭志睿, 王迪斌 申请人:南京医科大学第二附属医院, 南京博天科智生物技术有限公司