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专利名称：抗a族链球菌dna酶b抗体化学发光法诊断试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒(化学发光)及其使用方法。
背景技术：
化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay, CLIA)于 1977 年问世， 1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限度可达 IO-15^r18moI / L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)，HRP常用的底物为鲁米诺 (3—氨基邻苯二甲酰胼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4一氨基邻苯二甲酰胼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。然而，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，价格昂贵，操作复杂，从而限制了推广使用，无法有效广泛地应用于临床诊断和科研工作。

发明内容
本发明的目的在于提供一种价格低廉操作简单、采用化学发光法检测抗A族链球菌DNA酶B抗体的试剂盒及其使用方法。本发明的目的是这样实现的它包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、A族链球菌DNA酶B抗原包被板、化学发光底物液。其中化学发光底物液通过以下方法制备
A液在双蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷和浓HCl配成0. 05 0. 2M、pH6 10的1Tris-HCl 缓冲液；在Tris-HCl缓冲液中加入鲁米诺试剂、Tween20以及苯并荧蒽，并混合均勻；
B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0. 05、. 2M、pH4 5的柠檬酸缓冲液，在柠檬酸缓冲液中加入1(Γ40%过氧化氢溶液；
使用前，将A液和B液按照1 :1混合等到化学发光底物液。
其中，辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A的制备方法采用碘酸钠法制备，用改良过的过碘酸钠法将金黄色葡萄球菌蛋白A和辣根过氧化物酶联结在一起。其中，A族链球菌DNA酶B抗原包被板的制备如下将包被用浓度为0. Ing/ m广10 μ g/ml的A族链球菌DNA酶B重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻，将混勻的溶液加至包被板孔内，每孔100uL，4°C温育过夜，用含有TWerm20的磷酸盐缓冲液洗涤包被板后， 再加入含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液，室温静置1. 5^3小时后，弃去孔内液体， 彻底干燥包被板，厂铝钼袋真空包装，放2-8 °C保存；包被板是不透光的微孔板，包被板为 48孔或96孔。本发明还包括20倍浓缩洗涤液1瓶、阴性对照和阳性对照各1瓶、样品稀释液1瓶。其中的洗涤液是含有TWeen20的磷酸盐缓冲液的洗涤液；阴性对照为混合的正常人血清；阳性对照为新生牛血清稀释的抗A族链球菌DNA酶B抗体阳性人血清；样品稀释液为含有PH指示剂的磷酸盐缓冲液。抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒的使用方法如下
(1)自2、°C冰箱中取出试剂盒，室温平衡1(Γ30分钟；
(2)取出包被板条，插入板架上；
(3)每次实验设阴性对照3孔，阳性对照2孔，每孔分别加入阴性对照或阳性对照100 微升，样品孔中每孔加入样品稀释液100微升，再加入样品10微升，振荡混勻后贴上封板膜，置37°C温育2(Γ40分钟;
(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；
(5)除空白孔每孔加入酶标记物100微升，贴上封板膜，置37°C温育30分钟；
(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；
(7)使用前将化学发光底物液A和B以1:1混合，各孔均加入50微升的化学发光底物混合液，混合均勻，置室温避光反应5分钟；
(8)在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。根据待测样本的RLU值与临界值的比值S / CO值判断；若S / CO值》1，则为阳性反应，说明样本中含有抗A族链球菌DNA酶B抗体；若S / CO值<1，则为阴性反应，说明样本中不含有抗A族链球菌DNA酶B抗体。本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，成本低廉，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床抗A族链球菌DNA酶B抗体的检测提供了一种新的使用方法。


图1为本发明中苯并荧蒽的分子结构图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。本发明主要包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、A族链球菌 DNA酶B抗原包被板、化学发光底物液。
化学发光底物液由通过以下方法制备
A液在双蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷和浓HCl配成0. 1M、pH8. 5的Tris-HCl缓冲液；在Tris-HCl缓冲液中加入鲁米诺试剂、Tween20以及苯并荧蒽(苯并荧蒽分子结构图如图1所示)，并混合均勻；
B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0. 1Μ、ρΗ4. 6的柠檬酸缓冲液，在柠檬酸缓冲液中加入30%过氧化氢溶液；
使用前，将A液和B液按照1 :1混合等到化学发光底物液。辣根过氧化物酶(HRP)标记金黄色葡萄球菌蛋白A的制备方法采用碘酸钠法制备，“碘酸钠法”为传统方法，用改良过的过碘酸钠法将金黄色葡萄球菌蛋白A和辣根过氧化物酶联结在一起。A族链球菌DNA酶B抗原包被板的制备如下将包被用浓度为lOng/ml A族链球菌 DNA酶B重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻，加至包被板孔内，每孔lOOuL，4°C温育过夜，用含有TWerm20的磷酸盐缓冲液洗涤包被板3遍后，再加入含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥包被板，厂铝钼袋真空包装，放2-8 V 保存。，其中包被板是不透光的微孔板，包被板为48孔或96孔。 一般在辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、A族链球菌DNA酶B 抗原包被板、化学发光底物液组合的基础上还增加下述物质，分别是
20倍浓缩洗涤液1瓶、阴性对照和阳性对照各1瓶、样品稀释液1瓶。其中的洗涤液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液的洗涤液；阴性对照为混合的正常人血清，阳性对照为新生牛血清稀释的抗A族链球菌DNA酶B抗体阳性人血清。的阴性对照是混合的正常人血清； 样品稀释液为含有PH指示剂的磷酸盐缓冲液。至此所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒制备完成。本发明检测抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒的使用方法
(1)自2、°C冰箱中取出试剂盒，室温平衡1(Γ30分钟；
(2)取出包被板条，插入板架上；
(3)每次实验设阴性对照3孔，阳性对照2孔，每孔分别加入阴性对照或阳性对照100 微升，样品孔中每孔加入样品稀释液100微升，再加入样品10微升，振荡混勻后贴上封板膜，置37°C温育2(Γ40分钟;
(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；
(5)除空白孔每孔加入酶标记物100微升，贴上封板膜，置37°C温育30分钟；
(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；
(7)使用前将化学发光底物液A和B以1:1混合，各孔均加入50微升的化学发光底物混合液，混合均勻，置室温避光反应5分钟；
(8)在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。结果判定根据待测样本的相对光单位值(RLU)与临界值的比值S / CO值判断； 若S / CO值>1，则为阳性反应，说明样本中含有抗A族链球菌DNA酶B抗体；若S / CO值 <1，则为阴性反应，说明样本中不含有抗A族链球菌DNA酶B抗体。
权利要求
1.一种抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于它包括辣根过氧化物酶 (HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、A族链球菌DNA酶B抗原包被板、化学发光底物液。
2.根据权利要求1所述的一种抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒(化学发光法)， 其特征在于其中化学发光底物液通过以下方法制备A液在双蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷和浓HCl配成0. 05 0. 2M、pH6 10的1Tris-HCl 缓冲液；在Tris-HCl缓冲液中加入鲁米诺试剂、Tween20以及苯并荧蒽，并混合均勻；B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0. 05、. 2M、pH4 5的柠檬酸缓冲液，在柠檬酸缓冲液中加入1(Γ40%过氧化氢溶液；使用前，将A液和B液按照1 :1混合等到化学发光底物液。
3.权利要求1所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A的制备方法采用碘酸钠法制备，用改良过的过碘酸钠法将金黄色葡萄球菌蛋白A和辣根过氧化物酶联结在一起。
4 根据权利要求1所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于Α族链球菌DNA酶B抗原包被板的制备如下将包被用浓度为0. lng/m广10 μ g/ml的A族链球菌DNA酶B重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻，将混勻的溶液加至包被板孔内，每孔IOOuL, 4°C温育过夜，用含有TWerm20的磷酸盐缓冲液洗涤包被板后，再加入含有牛血清白蛋白 (BSA)的磷酸盐缓冲液，室温静置1. 5^3小时后，弃去孔内液体，彻底干燥包被板，厂铝钼袋真空包装，放2-8 °C保存。
5.根据权利要求4所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于包被板是不透光的微孔板，包被板为48孔或96孔。
6.根据权利要求1所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于它还包括20倍浓缩洗涤液1瓶、阴性对照和阳性对照各1瓶、样品稀释液1瓶。
7.根据权利要求6所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒，其特征在于其中的洗涤液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液的洗涤液；阴性对照为混合的正常人血清；阳性对照为新生牛血清稀释的抗A族链球菌DNA酶B抗体阳性人血清；样品稀释液为含有PH指示剂的磷酸盐缓冲液。
8 一种应用权利要求1-7所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒的使用方法， 其特征在于其使用方法为(1)自2、°C冰箱中取出试剂盒，室温平衡1(Γ30分钟；(2)取出包被板条，插入板架上；(3)每次实验设阴性对照3孔，阳性对照2孔，每孔分别加入阴性对照或阳性对照100 微升，样品孔中每孔加入样品稀释液100微升，再加入样品10微升，振荡混勻后贴上封板膜，置37°C温育2(Γ40分钟;(4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；(5)除空白孔每孔加入酶标记物100微升，贴上封板膜，置37°C温育30分钟；(6)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；(7)使用前将化学发光底物液A和B以1:1混合，各孔均加入50微升的化学发光底物混合液，混合均勻，置室温避光反应5分钟；(8)在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。
9.根据权利要求8所述的抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒的使用方法，其特征在于根据待测样本的RLU值与临界值的比值S / CO值判断；若S /⑶值》1，则为阳性反应，说明样本中含有抗A族链球菌DNA酶B抗体；若S / CO值<1，则为阴性反应，说明样本中不含有抗A族链球菌DNA酶B抗体。
全文摘要
本发明涉及一种化学发光法检测抗A族链球菌DNA酶B抗体诊断试剂盒及其使用方法。它包括辣根过氧化物酶(HRP) 标记的金黄色葡萄球菌蛋白A，A族链球菌DNA酶B抗原包被板，化学发光底物液。将包被用A族链球菌DNA酶B重组抗原加入到缓冲液中，混匀，移至发光微孔板内，4℃温育18小时，洗涤包被板后，加入封闭液，温育后弃去液体，充分干燥包被板，完成预包被包被板的制备；试剂盒中还包含有样品稀释液，浓缩洗涤液，阴性对照为正常人血清，阳性对照为含抗DNA酶B抗体阳性混合血清的人血清。本发明的试剂盒比微量法具有更高的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，成本低廉，并不需要昂贵的全自动化学发光测量仪。
文档编号G01N33/543GK102183636SQ201010613428
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者王滔 申请人:王滔