专利名称：一种养血清脑颗粒的质量检测方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种养血清脑颗粒的质量检测方法 背景技术
养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司研制的现代中药制剂，并于1996 年获得国家新药证书，并于1999年被列入国家基本药物目录，2000年被列入国家医保药品 目录。养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、鸡血藤、决明子、延胡索等11味中药组成，并经 现代高科技手段提取后，加入适当辅料，经混合制粒等制剂过程制成的一种颗粒剂。该制剂 具有有效成分溶出快，生物利用度高等优点。养血清脑颗粒具有养血平肝，活血通络的功 效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症，在临床上具有显著 的疗效。
目前养血清脑颗粒质量检测方法多采用薄层色谱法和高效液相色谱法。薄层色谱 法由于经济、简便、直观性强，应用于中药复方制剂鉴别频率最高，至今仍然是《中国药典》、 《英国药典》、印度草药典、欧洲药典等普遍应用的鉴别手段。高效液相色谱法多用于有效 成分的含量测定，其具有适用范围广、分离性能好、分析速度快、流动相选择范围宽、灵敏度 高、色谱柱可多次使用等优点。
但现有检测方法操作复杂，精度不高，实际操作过程中容易出现差错。发明内容_5] 所要解决的技术问题
本发明提供了一种养血清脑颗粒的质量检测方法，解决了目前检测中的一些重要 技术问题。
技术方案
本发明的养血清脑颗粒其处方如下
主药当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛。
辅料为糊精、甜菊素。
本发明所述的质量检测方法，包括鉴别方法和含量测定方法。
为此，本发明首先提供一种养血清脑颗粒的鉴别方法，该方法包括对以下成分的 鉴别
A夏枯草中熊果酸鉴别
B延胡索鉴别
C决明子鉴别
D当归和川芎鉴别
E夏枯草中迷迭香酸鉴别
F川芎中生物碱鉴别
G川芎中欧当归内酯A鉴别
H鸡血藤鉴别
I白芍鉴别
J熟地黄鉴别
K钩藤鉴别
本发明的鉴别方法采用薄层色谱法。
其次，本发明还包括对养血清脑颗粒中的有效成分进行含量测定，其中所述的有效成分为芍药苷。本发明的含量测定方法采用高效液相色谱法。
本发明的鉴别方法共有11项，可以使用其中一项作为对养血清脑颗粒的鉴别方法，也可以多项组合使用作为对养血清脑颗粒的鉴别方法，优选的是多项组合使用，最优选的是11项组合使用。
本发明的含量测定方法，色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸溶液(2-4 18-22 78-80)为流动相；检测波长为230_240nm。 理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
本发明的鉴别方法，优选采用以下方法
A夏枯草鉴别(熊果酸)
取本品O. 5-2. 0g，加稀盐酸O. 2-1. Oml和乙醚10_30ml，加热回流20-40分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每Iml含O. 1-1. Omg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-15 μ1、对照品溶液1-10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸(15-25 2-4 5-9 O. 1-0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-15%硫酸乙醇溶液，在100-120°C加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B延胡索鉴别
取本品O. 5-1. 5g，置具塞离心管中，加O. 1-0. 5mol/L氢氧化钠溶液2_6ml，振摇使溶解，加醋酸乙酯5-10ml，充分振�。胄�2-5分钟，取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇l_2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材O. 5-2. Og,加氨溶液(取浓氨试液1ml，加水10ml，混匀)0. 5-2. 0ml，研磨，加二氯甲烷5_20ml，温浸1_3小时，滤过，滤液浓缩至约 O. 5-2. Oml,作为对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每Iml含O. 1-1. Omg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5-15 μ 1，分别点于同一娃月父G薄层板上，以正己烧-氯仿-甲醇-浓氨试液(5-20 : 6-10 : 1-3 : O. 2-0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
C决明子鉴别
取决明子对照药材O. 5-1. 5g，加稀盐酸O. 5-1. Oml、乙醚10_20ml，水浴回流 O. 5-2. O小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为决明子对 照药材溶液。再取大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和橙黄决明素对照品，加无水乙醇-乙酸乙酯(1-4 O. 5-2)制成每Iml各含O. 5-1. Omg的溶液，作为混合对照品溶液。 照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草(熊果酸)”鉴别项中供试品溶液10-20 μ 1，对照药材溶液7-15μ I及混合对照品溶液2-4μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以石油醚(30 60°C )_环己烷-乙酸乙酯-甲酸(3-9 10-14 3-7 O. 2-0. 8)为展开剂，展开，取出， 晾干，置于氨蒸气中熏IOmin以上，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
D当归-川芎鉴别
分别取当归、川芎对照药材各O. 5-2. 0g，加乙醚10_30ml，水浴回流O. 5-2. O小时， 取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯O. 5-2. OmlU. 0-2. Oml使溶解， 作为当归、川芎对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草(熊果酸)”鉴别项中供试品溶液5-12 μ 1，当归对照药材溶液5-15 μ I和川芎对照药材溶液2-8 μ 1，分别点于同一娃胶G薄层板上，以正己烧-乙酸乙酯-甲酸(5-9 : O. 5-1. 5 : O. 2-0. 8)为展开剂,展开 8cm以上，取出，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
E夏枯草鉴别(迷迭香酸)
取迷迭香酸对照品，加稀乙醇制成每Iml含O. 5-1. Omg的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草(熊果酸)”鉴别项中供试品溶液1-5 μ1、对照品溶液 1_4μ1,分别点于同一娃胶G薄层板上，以正己烧-乙酸乙酯-甲酸(1-3 : 5-6 : O. 2-0. 5) 为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
F川芎鉴别(生物碱类)
取本品5-20g，加入氨水3-8ml，及乙醚30_50ml，密塞静置30-90分钟，玻璃棒搅匀， 水浴回流20-40分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液。取川芎对照药材O. 5-2. 0g，加氨水3-8ml，及乙醚10_30ml，密塞静置50-70分钟，水浴回流20-40分钟，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇O. 5-2. Oml使溶解，作为川芎对照药材溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取川芎对照药材溶液7-10 μ1、供试品溶液7-12 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(7-11 O. 5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液 (1-4 0.5-1)混合溶液，置于日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
G川芎鉴别(欧当归内酯Α)
取本品2-10g，加入乙醚20_60ml，水浴回流20_60分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液。另取欧当归内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每Iml含O. 2-1. Omg的溶液，作为欧当归内酯A对照品溶液。照薄层色谱法试验， 分别吸取欧当归内酯A对照品溶液2-6 μ1、供试品溶液6-10 μ 1，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(1-5 O. 5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯 (254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
H鸡血藤鉴别
取本品5-20g，加入O. 1-0. 5%氢氧化钠溶液20_50ml，摇匀，超声处理20_40min， 取出，离心(2000-6000转/分钟，3-10分钟)，取上清液，用石油醚(60 90。。)萃取1-3 次，每次10_20ml，弃去石油醚层，取水层加O. 3-0. 6ml稀盐酸，摇匀，用乙醚萃取1_3次，每次10-20ml，合并乙醚萃取层，回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml溶解，加入硅胶l_2g 拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱(100 200目，l_3g，内径lcm，干法装柱)上，用甲醇-三氯甲烷(O. 5-1.5 7-ll)30-50ml洗脱，收集甲醇-三氯甲烷(O. 5-1. 5 7-11)洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷O. 5-1. 5ml使溶解，作为供试品溶液。另取芒柄花素适量，加甲醇制成每Iml含O. 1-0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取芒柄花素对照品溶液2-5 μ1、供试品溶液5-10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇 (10-40 I)为展开剂，展开8cm以上，取出，晾干，置于紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
I白芍鉴别
照薄层色谱法试验，分别吸取含量测定项中供试品溶液20-30 μ I及芍药苷对照品溶液10-20 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (20-50 3-7 5-15 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3_5%香草醛硫酸溶液，在 100-12(TC加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
J熟地黄鉴别
取本品15_20g，加水50_100ml，于50_60°C温热20-50分钟，取出，超声处理 20-40分钟，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，每次20-40ml，合并乙酸乙酯，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯3-10ml使溶解，加入中性氧化铝2-4g，拌匀，装入中性氧化铝柱(10-15g,内径15mm, 70 100目)，用乙醇20_50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残洛加乙醇O. 5-2. 0ml，使溶解，作为供试品溶液。另取熟地黄对照药材2-5g，加水30_80ml煎煮 O. 5-2. O小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取1-3次，每次20-40ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇O. 5-2. 0ml，使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液20-25 μ I及对照药材溶液10-20 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(0.5-2 I)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4_ 二硝基苯肼乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
K钩藤鉴别
取本品5_20g,加浓氨试液5_15ml使浸润，密塞20-40分钟，加入乙醚50-100ml, 加热回流O. 5-2. O小时，放冷，分取乙醚层，用3-8 %盐酸溶液振摇提取1-3次，每次 10-30ml，合并3-8%盐酸溶液，用氨水调节pH值至9，用乙醚振摇提取1_3次，每次 10-30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液。另取钩藤对照药材l_3g，加浓氨试液2-5ml浸润，密塞20-40分钟，加乙醚20_50ml，加热回流O. 5-2. O 小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-20 μ I，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(6-10 10-14 1-3 1-3 O. 5-0. 8)为展开剂，展开，取出，晾干， 改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(1-4 O. 5-1)混合溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的主斑点。
本发明的含量测定方法， 优选采用以下方法
用高效液相色谱法测定芍药苷的含量
高效液相色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸溶液(2-4 18-22 78-80)为流动相；检测波长为230_240nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加70-90%甲醇制成每Iml 含15-25 μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内存物，研细，取约O. 06-0. 10g，精密称定，置20-50ml烧杯中，加碳酸氢钠溶液5ml，超声处理，加在DlOl型大孔吸附树脂柱上，用 10-20ml水洗脱，弃去洗脱液，再用6-10ml甲醇洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心4-6分钟，取上清液，S卩得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明最优选的含量测定方法如下
高效液相色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/ L枸橼酸溶液(2-4 18-22 78-80)为流动相；检测波长为230_240nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每Iml含 20 μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内存物，研细，取约O. 08g，精密称定，置 20ml烧杯中，加O. 2%碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz) 5分钟，加在 DlOl型大孔吸附树脂柱(60 80目，内径6 8mm，高约5cm)上，用水15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得。
有益效果
本发明中，TLC法可定性检测出养血清脑颗粒中当归、川芎、鸡血藤、决明子、夏枯草、钩藤、白芍、延胡索和熟地黄，该方法简单、稳定，可作为养血清脑颗粒的定性检测方法。 HPLC法可测定养血清脑颗粒中芍药苷的含量，方法简便，重复性和稳定性好，结果准确可靠，可作为养血清脑颗粒的含量检测方法。
试验中比较不同的流动相系统，发现异丙醇-甲醇-枸橼酸水溶液系统能使本品中芍药苷得到很好的分离，且经过不同的流动相配比选择，故本发明最终选择了异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2-4 20-22 78-80)作为流动相。
图1 :青岛硅胶 G 板，T = 22°C，RH = 41%
从左至右样品(批号2011C10);样品(批号2011C11)；;样品(批号 2011C12)；
熊果酸对照品
图2 :青岛硅胶 G 板，T = 22°C，RH = 41%
从左至右样品(批号2010F27);样品(批号2010F28);延胡索乙素对照品(中检所，110726-201011);延胡索对照药材(中检所，120928-200604);样品(批号 2010F29)；
图3 :烟台 HSG，T = 24°C ;RH = 27%
自左到右阴性样品溶液；决明子对照药材；供试品(批号2010B01);供试品(批号2010B02);供试品(批号2010B03);供试品(批号2010B04)；
供试品(批号2010B05);供试品(批号2010B06);供试品(批号2010B07)；
供试品(批号2010B08);供试品(批号2010B09);供试品(批号2010B10)；
大黄素甲醚对照品；大黄酚对照品；大黄素对照品；橙黄决明素对照品图4 :烟台硅胶 G 板，T = 21°C ；RH = 23%
自左到右空白样品溶液；当归对照药材；供试品溶液(批号2009J23);供试品溶液(批号2009K25);供试品溶液(批号2009L03);川芎对照药材图5 :烟台硅胶G板，T =25 °C, RH = 66%
从左至右阴性样品；迷迭香Ife对照品；样品(批号2010D01);样品(批号 2010D02);样品(批号2010D03)
图6 :烟台硅胶 G 板，T = 26°C，RH = 50%
自左到右阴性(缺川芎)；当归对照药材；供试品(批号2009J23);供试品(批号2009L02);供试品(批号2009L03);川芎对照药材10 μ I ；
图7 :烟台硅胶 GF254 板，T = 24°C, RH = 52%
自左到右阴性；欧当归内酯A ;供试品2009J23 ;供试品2009L02 ;供试品2009L03 图8 :青岛硅胶G板，T = 27°C, RH = 48%
自左到右阴性；芒柄花素；供试品2009J23 ;供试品2009K25 ;供试品2010C30 ；
图9 :烟台硅胶 G 板，T = 25°C，RH = 36%
自左到右阴性样品溶液；苟药昔对照品；供试品(批号2010B01);供试品 (批号2010B02);供试品(批号2010B03);供试品(批号2010B04);供试品(批号 2010B05);供试品(批号2010B06);供试品(批号2010B07)；
供试品(批号2010B08);供试品(批号=2OlOBO9);供试品(批号2010B10)；
图10 :烟台硅胶 G 板，T = 25°C, RH = 47%
自左到右阴性样品溶液；熟地黄对照药材；供试品(批号2010B01);供试品(批号2010B02);供试品(批号2010B03)；
图11 :烟台硅胶 G 板，T = 220C ；RH = 28%
自左到右阴性样品溶液；钩藤对照药材；供试品(批号2010B01);供试品(批号2010B02);供试品(批号2010B03)；
图12 :测定芍药苷含量的HPLC图谱具体实施方式
I仪器与试药
Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2996PDA 检测器，Empower2 工作站； Mill1-Q超纯水机。
芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，110736-200731)，阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，0773-9910)，当归对照药材(中国药品生物制品检定所， 120927-200310)，川芎对照药材(中国药品生物制品检定所，120918-200809)，迷迭香酸对照品(天津一方科技有限公司)，夏枯草对照药材(中国药品生物制品检定所， 120993-200604)，决明子对照药材(中国药品生物制品检定所，121544-200501)，大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所，110796-200311)，橙黄决明素(天津一方科技有限公司)， 芒柄花素对照品(中国药品生物制品检定所，111703-200501)，熟地黄对照药材(中国药品生物制品检定所，121196-200803)
甲醇、四氢呋喃为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
实施例1
夏枯草鉴别(熊果酸)
供试品溶液的制备取本品lg，加稀盐酸O. 5ml和乙醚20ml，加热回流30分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇O. 5ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取熊果酸对照品，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液，作为对照品溶液。
展开剂的选择分别配制20 3 7 O. 2比例的，15 2 5 O .1比例的， 25 : 4 : 9 : 0.5比例的环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸为展开剂。
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ1、对照品溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图 (1-1)。其中以20 : 3 : 7 : 0.2比例的环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸为展开剂斑点最明显。
实施例2
延胡索鉴别
供试品溶液的制备取本品lg，置具塞离心管中，加O. 2mol/L氢氧化钠溶液4ml， 振摇使溶解，加醋酸乙酯5ml，充分振�。胄�2分钟，取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备延胡索对照药材O. 5g，加氨溶液(取浓氨试液1ml，加水 IOml,混勻)0. 5ml,研磨,加二氯甲烧IOml,温浸2小时,滤过,滤液浓缩至约Iml,作为对照药材溶液。
对照品溶液的制备取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液，作为对照品溶液。
展开剂的选择分别配制15 8 2 O. 2比例的，5 6 I O. 2比例的， 20 10 3 0.5比例的正己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液为展开剂。
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图(2-1)。其中以15 : 8 : 2 : 0.2比例的正己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液为展开剂斑点最明显。
实施例3
决明子鉴别
供试品溶液的制备取本品2g，加稀盐酸Iml和乙醚20ml，加热回流30分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，即得。
空白溶液的制备取缺决明子的空白药物制剂，依供试品溶液的制备方法制得空白溶液。
对照药材的制备取决明子对照药材lg，加稀盐酸O. 5ml、乙醚20ml，水浴回流I 小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加甲醇Iml使溶解，即得。
对照品溶液的制备取大黄酚对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品和橙黄决明素，加无水乙醇-乙酸乙酯(2 :1)制成每Iml各含O. 5mg的溶液，作为对照品溶液。
展开剂的选择分别配制6 12 5 O. 5比例的，3 10 3 O. 2的比例的，9 14 7 O. 8比例的石油醚(30 60°C)_环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μ 1，对照药材溶液7及混合对照品溶液2μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下展开，取出，晾干，置于氨蒸气中熏IOmin以上，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图(3-3)。其中以6 : 12 : 5 : O. 5比例的石油醚(30 60°C)_环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显。·
实施例4
当归-川芎鉴别
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒2g，加入稀盐酸Iml和乙醚20ml，混匀，60°C 水浴加热回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5ml溶解，即得。
对照药材溶液的制备分别取当归对照药材、川芎对照药材各lg，加乙醚20ml，水浴回流I小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯Iml使溶解，分别作为当归、川芎对照药材溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除当归、川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制9 I O. 5比例的，5 O. 5 O. 2比例的，9 1.5 0.8比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂。
照薄层色谱法试验，吸取鉴别(I)项中供试品溶液10μ1，当归对照药材溶液10μ I和川芎对照药材溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开IOcm以上，取出，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图(4-1)。其中以9 I 0.5比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显。
实施例5
夏枯草鉴别(迷迭香酸)
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒2g，加入稀盐酸Iml和乙醚20ml，混匀，60°C 水浴加热回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5ml溶解，即得。
对照品溶液的制备取迷迭香酸对照品(天津一方科技有限公司，含量为98% )， 加稀乙醇制成每Iml含O. 5mg的溶液，作为对照品溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除夏枯草外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制2 4 O. 2比例的，I 5 O. 2比例的，3 6 O. 5 比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂。
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5 μ1、对照品溶液4 μ 1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
见图(5-1)。其中以2 : 4 : 0.2比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显。
实施例6
川芎鉴别(生物碱类)
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒10g，加入氨水5ml，及乙醚40ml，密塞静置 60分钟，玻璃棒搅匀，水浴回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇 Iml使溶解，即得。
对照药材溶液的制备取川芎对照药材lg，加氨水5ml，及乙醚20ml，密塞静置60 分钟，水浴回流30分钟，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇Iml使溶解， 即得，作为川芎对照药材溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制9 I比例的，7 O. 5比例的，11:2比例的环己烷-乙酸乙酯为展开剂。
照薄层色谱法试验，分别吸取川芎对照药材溶液10 μ1、供试品溶液12 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(I I)混合溶液，置于日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图(6-1)。其中以9 I比例的环己烷-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显。
实施例7
川芎鉴别(欧当归内酯Α)
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒4g，加入乙醚40ml，水浴回流30分钟，取出， 放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇Iml使溶解，即得。
对照品溶液的制备取欧当归内酯A对照品20mg，置于50ml棕色容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇勻，即得，作为欧当归内酯A对照品溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制3 I比例的，I O. 5比例的，5 2比例的正己烷-乙酸乙酯为展开剂。
照薄层色谱法试验，分别吸取欧当归内酯A对照品溶液6 μ1、供试品溶液10 μ 1， 分别点于同一硅胶GF254薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，置于紫外光灯 (254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图(7-1)。其中以3 I比例的正己烷-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显。
实施例8
鸡血藤鉴别
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒10g，加入O. 2%氢氧化钠溶液30ml，摇匀，超声处理30min，取出，离心(2000转/分钟，5分钟)，取上清液，用石油醚(60 90°C )萃取 2次，每次15ml，弃去石油醚层，取水层加O. 4ml稀盐酸，摇匀，用乙醚萃取3次，每次15ml， 合并乙醚萃取层，回收乙醚至干，残渣加甲醇2ml溶解，加入硅胶Ig拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱(100 200目，2g，内径lcm，干法装柱)上，用甲醇-三氯甲烷(I 9) 40ml洗脱，收集甲醇-三氯甲烷(I 9)洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，即得。
对照品溶液的制备精密称取芒柄花素适量，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液， 作为对照品溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除鸡血藤外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。
展开剂的选择30 I比例的，10 I比例的，40 I比例的三氯甲烷-甲醇为展开剂。
照薄层色谱法试验，分别吸取芒柄花素对照品溶液2 5 μ1、供试品溶液5 10μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件，展开12cm，取出，晾干，置于紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图(8-1)。其中以30 I比例的三氯甲烷-甲醇为展开剂斑点最清晰。
实施例9
白芍鉴别
供试品溶液的制备取养血清脑颗粒，研细，取约O. 08g，精密称定，置20ml烧杯中，加O. 2%碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz) 5分钟，加在DlOl型大孔吸附树脂柱(60 80目，内径6 8_，高约5cm)上，用水15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液，即得。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每Iml含 20 μ g的溶液，即得。
空白溶液的制备按处方配比，取除白芍外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制40 5 10 O. 2比例的，20 3 5 O. 2比例的， 50 : 7 : 15 : O. 2比例的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂。
照薄层色谱法试验，分别吸取含量测定项中供试品溶液20 μ I及芍药苷对照品溶液10μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以5% 香草醛硫酸溶液，在105°C加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。见图(9-1)。其中以40 5 10 O. 2比例的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂斑点最明显。
实施例10
熟地黄鉴别
供试品溶液的制备取本品20g，加水100ml，于60°C温热30分钟，取出，超声处理30分钟，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯，乙酸乙酯液蒸干， 残渣加乙酸乙酯5ml使溶解，加入中性氧化铝3g，拌匀，装入中性氧化铝柱(10g，内径15mm， 70 100目)，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇Iml，使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备取熟地黄对照药材4g，加水50ml煎煮I小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇1ml，使溶解，作为对照药材溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除熟地黄外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制1:1比例的，O. 5 I比例的，2 I比例的甲苯-乙酸乙酯为展开剂。
照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液20 μ I及对照药材溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以2，4-二硝基苯肼乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图(10-1)。其中以1:1比例的甲苯-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显。
实施例11
钩藤鉴别
供试品溶液的制备取本品10g，加浓氨试液IOml使浸润，密塞30分钟，加入乙醚 100ml，加热回流I小时，放冷，分取乙醚层，用5%盐酸溶液振摇提取2次，每次20ml，合并 5%盐酸溶液，用氨水调节pH值至9，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备取钩藤对照药材2g，加浓氨试液3ml浸润，密塞30分钟，加乙醚40ml，加热回流I小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇Iml使溶解，作为对照药材溶液。
空白溶液的制备按处方配比，取除钩藤外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液。
展开剂的选择分别配制8 12 2 2 O. 5比例的，6 10 I I O. 5 比例的，10 14 3 3 0.8比例的甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开齐U。 照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(I I)混合溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的主斑点。见图(11-1)。 其中以8 12 2 2 0.5比例的甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂斑点最明显。
实施例12
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2 : 22 78)为流动相；检测波长为240nm ;柱温30°C。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述芍药苷对照品溶液5ml，置50ml容量瓶中， 加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约O. 08g，精密称定，置IOml容量瓶中，加入O. 2%碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz) 10分钟，加在DlOl型大孔吸附树脂柱(60 80目，内径6 8_，高约5cm)上，用水15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇 8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中加水至刻度，摇匀，过O. 45 μ m微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得。
实施例13
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(4 20 80)为流动相；检测波长为230nm ;柱温30°C。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述芍药苷对照品溶液5ml，置50ml容量瓶中， 加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约O. 08g，精密称定，置IOml容量瓶中，加入O. 2%碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz) 10分钟，加在DlOl型大孔吸附树脂柱(60 80目，内径6 8_，高约5cm)上，用水15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇 8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中加水至刻度，摇匀，过O. 45 μ m微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得。·
权利要求
1.一种养血清脑颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括对以下成分的鉴别A夏枯草中熊果酸鉴别B延胡索鉴别 C决明子鉴别 D当归和川芎鉴别 E夏枯草中迷迭香酸鉴别 F川芎中生物碱鉴别 G川芎中欧当归内酯A鉴别 H鸡血藤鉴别 I白芍鉴别 J熟地黄鉴别 K钩藤鉴别。
2.根据权利要求1的质量检测方法，其特征在于，鉴别方法采用薄层色谱法。
3.根据权利要求1的质量检测方法，其特征在于，还包括对养血清脑颗粒中的有效成分芍药苷进行含量测定，含量测定方法采用高效液相色谱法。
4.根据权利要求1的质量检测方法，其特征在于，使用其中一项作为对养血清脑颗粒的鉴别方法，或多项组合使用作为对养血清脑颗粒的鉴别方法。
5.根据权利要求4的质量检测方法，其特征在于，是11项鉴别方法组合使用。
6.根据权利要求5的质量检测方法，其特征在于，是11项鉴别方法组合使用，同时对养血清脑颗粒中的有效成分芍药苷进行含量测定。
7.根据权利要求1的质量检测方法，其特征在于，所述夏枯草中熊果酸鉴别，步骤如下取本品O. 5-2. Og,加稀盐酸O. 2-1. Oml和乙醚10_30ml，加热回流20-40分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液，另取熊果酸对照品，加甲醇制成每Iml含O. 1-1. Omg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 5-15 μ1、对照品溶液1-10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸(15-25 2-4 5-9 O. 1-0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-15%硫酸乙醇溶液，在100-120°C加热至显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述延胡索鉴别，步骤如下取本品O. 5-1. 5g，置具塞离心管中，加O. 1-0. 5mol/L氢氧化钠溶液2_6ml，振摇使溶解，加醋酸乙酯5-10ml，充分振�。胄�2-5分钟，取上层溶液，蒸干,残渣加甲醇l_2ml使溶解，作为供试品溶液，另取延胡索对照药材O. 5-2. 0g，加氨溶液O. 5-2. 0ml，研磨，加二氯甲烷5-20ml，温浸1-3小时，滤过，滤液浓缩至约O. 5-2. 0ml，作为对照药材溶液，再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每Iml含O. 1-1. Omg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验， 吸取上述三种溶液各5-15 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液(5-20 6-10 1-3 O. 2-0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液， 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述决明子鉴别，步骤如下取决明子对照药材O. 5-1. 5g，加稀盐酸O. 5-1. 0ml、乙醚10-20ml，水浴回流O. 5-2. O小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为决明子对照药材溶液，再取大黄素甲醚、大黄酚、大黄素和橙黄决明素对照品，加无水乙醇-乙酸乙酯(1-4 O. 5-2)制成每Iml各含O. 5-1. Omg的溶液，作为混合对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草中熊果酸”鉴别项下供试品溶液10-20 μ 1，对照药材溶液7-15μ I及混合对照品溶液2-4 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以石油醚(30 60°C )-环己烷-乙酸乙酯-甲酸(3-9 10-14 3-7 O. 2-0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置于氨蒸气中熏IOmin以上，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述当归和川芎鉴别，步骤如下分别取当归、川芎对照药材各O. 5-2. 0g，加乙醚10-30ml，水浴回流O. 5-2. O小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯O. 5-2. OmlU. 0-2. Oml使溶解，作为当归、川芎对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草中熊果酸”鉴别项下供试品溶液5-12 μ 1，当归对照药材溶液5-15 μ I和川芎对照药材溶液2-8 μ 1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烧-乙酸乙酯-甲酸(5-9 O. 5-1. 5 O. 2-0. 8)为展开剂,展开8cm以上，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；所述夏枯草中迷迭香酸鉴别，步骤如下取迷迭香酸对照品，加稀乙醇制成每Iml含O. 5-1. Omg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取“夏枯草中熊果酸”鉴别项下供试品溶液1_5μ1、对照品溶液1_4μ 1， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(1-3 5-6 O. 2-0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点；所述川芎中生物碱鉴别，步骤如下取本品5-20g，加入氨水3-8ml，及乙醚30_50ml，密塞静置30-90分钟，玻璃棒搅匀， 水浴回流20-40分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液，取川芎对照药材O. 5-2. Og,加氨水3-8ml，及乙醚10_30ml，密塞静置50-70分钟，水浴回流20-40分钟，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇O. 5-2. Oml使溶解，作为川芎对照药材溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取川芎对照药材溶液7-10 μ1、供试品溶液7-12 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(7-11 0.5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液 (1-4 0.5-1)混合溶液，置于日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述川芎中欧当归内酯A鉴别，步骤如下取本品2-10g，加入乙醚20-60ml，水浴回流20-60分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液，另取欧当归内酯A对照品，加乙酸乙酯制成每Iml含O. 2-1. Omg的溶液，作为欧当归内酯 A对照品溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取欧当归内酯A对照品溶液2-6 μ1、供试品溶液6-10 μ 1，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(1-5 O. 5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；所述鸡血藤鉴别，步骤如下取本品5-20g，加入O. 1-0. 5%氢氧化钠溶液20-50ml，摇匀，超声处理20_40min，取出， 离心，取上清液，用石油醚(60 90°C)萃取1-3次，每次10-20ml，弃去石油醚层，取水层加O. 3-0. 6ml稀盐酸，摇匀，用乙醚萃取1-3次，每次10_20ml，合并乙醚萃取层，回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml溶解，加入硅胶l_2g拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱上，用甲醇-三氯甲烷(O. 5-1.5 7-11) 30-50ml洗脱，收集甲醇-三氯甲烷(O. 5-1. 5 7-11)洗脱液， 蒸干，残渣加三氯甲烷O. 5-1. 5ml使溶解，作为供试品溶液，另取芒柄花素适量，加甲醇制成每Iml含O. 1-0. 5mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取芒柄花素对照品溶液2-5 μ1、供试品溶液5-10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇 (10-40 I)为展开剂，展开8cm以上，取出，晾干，置于紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；所述白芍鉴别，步骤如下照薄层色谱法试验，分别吸取含量测定项中供试品溶液20-30μ I及芍药苷对照品溶液10-20 μ I,分别点于同一娃胶G薄层板上，以三氯甲烧-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (20-50 3-7 5-15 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3_5%香草醛硫酸溶液，在 100-12(TC加热至显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述熟地黄鉴别，步骤如下取本品15-20g，加水50-100ml，于50_60°C温热20-50分钟，取出，超声处理20-40分钟，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，每次20-40ml，合并乙酸乙酯，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯3-10ml使溶解，加入中性氧化铝2-4g，拌匀，装入中性氧化铝柱，用乙醇20-50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇O. 5-2. 0ml，使溶解，作为供试品溶液，另取熟地黄对照药材2-5g，加水30-80ml煎煮O. 5-2. O小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取1_3次， 每次20-40ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇O. 5-2. 0ml，使溶解，作为对照药材溶液，照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液20-25 μ I及对照药材溶液10-20 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(O. 5-2 I)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 2，4-二硝基苯肼乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述钩藤鉴别，步骤如下 取本品5-20g，加浓氨试液5-15ml使浸润，密塞20-40分钟，加入乙醚50_100ml，加热回流O. 5-2. O小时，放冷，分取乙醚层，用3-8%盐酸溶液振摇提取1-3次，每次10-30ml，合并3-8%盐酸溶液，用氨水调节pH值至9，用乙醚振摇提取1-3次，每次10-30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为供试品溶液，另取钩藤对照药材l_3g，加浓氨试液2-5ml浸润，密塞20-40分钟，加乙醚20_50ml，加热回流O. 5-2. O小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇O. 5-2. Oml使溶解，作为对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-20 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水(6-10 10-14 1-3 1-3 O. 5-0. 8)为展开剂，展开，取出，晾干，改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(1-4 O. 5-1)混合溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的主斑点。
8.根据权利要求2的质量检测方法，其特征在于，所述夏枯草中熊果酸鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取本品2g，加稀盐酸1. Oml和乙醚20ml，加热回流30分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇O. 5ml使溶解，作为供试品溶液，对照品溶液的制备取熊果酸对照品，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液，作为对照品溶液，展开剂的选择分别配制20 3 7 O. 2比例的，15 2 5 O.1比例的， 25 : 4 : 9 : 0.5比例的环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸为展开剂，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液IOy1、对照品溶液5μ1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以 20 : 3 : 7 : O. 2比例的环己烷-醋酸乙酯-氯仿-冰醋酸为展开剂斑点最明显；所述延胡索鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取本品lg，置具塞离心管中，加O. 2mol/L氢氧化钠溶液4ml，振摇使溶解，加醋酸乙酯5ml，充分振�。胄�2分钟，取上层溶液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解， 作为供试品溶液，对照药材溶液的制备延胡索对照药材O. 5g，加氨溶液O. 5ml，研磨，加二氯甲烷10ml， 温浸2小时，滤过，滤液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液，对照品溶液的制备取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液，作为对照品溶液，展开剂的选择分别配制15 8 2 O. 2比例的，5 6 I O. 2比例的， 20 10 3 0.5比例的正己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液为展开剂，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以15 8 2 0.2比例的正己烷-氯仿-甲醇-浓氨试液为展开剂斑点最明显；所述决明子鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取本品2g，加稀盐酸1. Oml和乙醚20ml，加热回流30分钟，提取液挥尽乙醚，残渣加甲醇Iml使溶解，即得，空白溶液的制备取缺决明子的空白药物制剂，依供试品溶液的制备方法制得空白溶液，对照药材的制备取决明子对照药材lg，加稀盐酸O. 5ml、乙醚20ml，水浴回流I小时， 取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加甲醇Iml使溶解，即得，对照品溶液的制备取大黄酚对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品和橙黄决明素，加无水乙醇-乙酸乙酯(2 :1)制成每Iml各含O. 5mg的溶液，作为对照品溶液，展开剂的选择分别配制6 12 5 0.5比例的，3 10 3 0.2的比例的，.9 14 7 0.8比例的石油醚(30 60°C )_环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1，对照药材溶液7及混合对照品溶液2 μ 1，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下展开，取出，晾干，置于氨蒸气中熏IOmin以上，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以6 : 12 : 5 : O. 5比例的石油醚(30 60°C)_环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显；所述当归和川芎鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒2g，加入稀盐酸Iml和乙醚20ml，混匀，60°C水浴加热回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5ml溶解，即得，对照药材溶液的制备分别取当归对照药材、川芎对照药材各lg，加乙醚20ml，水浴回流I小时，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯Iml使溶解，分别作为当归、川芎对照药材溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除当归、川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制9 I O. 5比例的，5 O. 5 O. 2比例的，9 1. 5 O. 8 比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μ 1，当归对照药材溶液10 μ I和川芎对照药材溶液5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开IOcm以上，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，其中以9 I O. 5比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显； 所述夏枯草中迷迭香酸鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒2g，加入稀盐酸Iml和乙醚20ml，混匀，60°C水浴加热回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇O. 5ml溶解，即得，对照品溶液的制备取迷迭香酸对照品，加稀乙醇制成每Iml含O. 5mg的溶液，作为对照品溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除夏枯草外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制2 4 O. 2比例的，I 5 O. 2比例的，3 6 O. 5比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μ1、对照品溶液4μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，其中以2 4 O. 2比例的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂斑点最明显；所述川芎中生物碱鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒10g，加入氨水5ml，及乙醚40ml，密塞静置60分钟，玻璃棒搅匀，水浴回流30分钟，取出，放冷，提取液回收乙醚至干，残渣加无水乙醇Iml 使溶解，即得，对照药材溶液的制备取川芎对照药材lg，加氨水5ml，及乙醚20ml，密塞静置60分钟，水浴回流30分钟，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干,残渣加无水乙醇Iml使溶解，即得，作为川芎对照药材溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制9 I比例的，7 0.5比例的，11 2比例的环己烷-乙酸乙酯为展开剂，照薄层色谱法试验，分别吸取川芎对照药材溶液10 μ1、供试品溶液12 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(I I)混合溶液，置于日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以9 I比例的环己烷-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显； 所述川芎中欧当归内酯A鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒4g，加入乙醚40ml，水浴回流30分钟，取出，放冷， 提取液回收乙醚至干，残渣加甲醇Iml使溶解，即得，对照品溶液的制备取欧当归内酯A对照品20mg，置于50ml棕色容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，摇匀，即得，作为欧当归内酯A对照品溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除川芎外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制3 I比例的，I O. 5比例的，5 2比例的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，照薄层色谱法试验，分别吸取欧当归内酯A对照品溶液6μ1、供试品溶液10μ 1，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，其中以3 I比例的正己烷-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显；所述鸡血藤鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒10g，加入O. 2%氢氧化钠溶液30ml，摇匀，超声处理30min，取出，离心，取上清液，用石油醚(60 90°C )萃取2次，每次15ml，弃去石油醚层，取水层加O. 4ml稀盐酸，摇匀，用乙醚萃取3次，每次15ml，合并乙醚萃取层，回收乙醚至干，残渣加甲醇2ml溶解，加入硅胶Ig拌匀，挥干溶剂，置硅胶柱上，用甲醇-三氯甲烷 (I 9)40ml洗脱，收集甲醇-三氯甲烷(I 9)洗脱液，蒸干，残渣加三氯甲烷Iml使溶解，即得，对照品溶液的制备精密称取芒柄花素适量，加甲醇制成每Iml含O.1mg的溶液，作为对照品溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除鸡血藤外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液，展开剂的选择30 I比例的，10 I比例的，40 I比例的三氯甲烷-甲醇为展开 剂，照薄层色谱法试验，分别吸取芒柄花素对照品溶液2 5 μ1、供试品溶液5 10 μ 1， 分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件，展开12cm，取出，晾干，置于紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，其中以 30 I比例的三氯甲烷-甲醇为展开剂斑点最清晰；所述白芍鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取养血清脑颗粒，研细，取约O. 08g，精密称定，置20ml烧杯中，加O.2%碳酸氢钠溶液5ml，超声处理5分钟，加在DlOl型大孔吸附树脂柱上，用水15ml洗脱， 弃去洗脱液，再用甲醇8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心5分钟，取上清液，即得，对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每Iml含20 μ g 的溶液，即得，空白溶液的制备按处方配比，取除白芍外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制40 5 10 O. 2比例的，20 3 5 O. 2比例的， 50 : 7 : 15 : O. 2比例的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，照薄层色谱法试验，分别吸取含量测定项中供试品溶液20 μ I及芍药苷对照品溶液 IOy 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105°C加热至显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以40 5 10 O. 2比例的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂斑点最明显；所述熟地黄鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取本品20g，加水100ml，于60°C温热30分钟，取出，超声处理30分钟，离心，取上清液，用乙酸乙酯萃取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯，乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯5ml使溶解，加入中性氧化铝3g，拌匀，装入中性氧化铝柱，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1ml，使溶解，作为供试品溶液，对照药材溶液的制备取熟地黄对照药材4g，加水50ml煎煮I小时，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇1ml，使溶解，作为对照药材溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除熟地黄外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制1:1比例的，O. 5 I比例的，2 I比例的甲苯-乙酸乙酯为展开剂，照薄层色谱法试 验，分别吸取供试品溶液20 μ I及对照药材溶液10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，喷以2，4- 二硝基苯肼乙醇溶液， 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，其中以1:1比例的甲苯-乙酸乙酯为展开剂斑点最明显；所述钩藤鉴别，步骤如下供试品溶液的制备取本品10g，加浓氨试液IOml使浸润，密塞30分钟，加入乙醚 100ml，加热回流I小时，放冷，分取乙醚层，用5%盐酸溶液振摇提取2次，每次20ml，合并 5%盐酸溶液，用氨水调节pH值至9，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液，对照药材溶液的制备取钩藤对照药材2g，加浓氨试液3ml浸润，密塞30分钟，加乙醚 40ml，加热回流I小时，放冷，滤过，滤液蒸干，加甲醇Iml使溶解，作为对照药材溶液，空白溶液的制备按处方配比，取除钩藤外其他药材依法制成阴性样品，再按照供试品溶液制备方法制得空白溶液，展开剂的选择分别配制8 12 2 2 O. 5比例的，6 10 I I O. 5比例的，10 14 3 3 0.8比例的甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂， 照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，在上述展开剂条件下，展开，取出，晾干，改良碘化铋钾溶液-碘碘化钾溶液(I I) 混合溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的主斑点，其中以 8 : 12 : 2 : 2 : O. 5比例的甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂斑点最明显。
9.根据权利要求3的质量检测方法，其特征在于，所述的含量测定方法，步骤如下色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸溶液 (2-4 18-22 78-80)为流动相；检测波长为230_240nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000，对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加70-90%甲醇制成每Iml含 15-25 μ g的溶液，得到对照品溶液；供试品溶液的制备取养血清脑颗粒，研细，取O. 06-0. 10g，精密称定，置20-50ml烧杯中，加碳酸氢钠溶液5ml，超声处理，加在DlOl型大孔吸附树脂柱上，用10-20ml水洗脱，弃去洗脱液，再用6-10ml甲醇洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中，加水至刻度，摇勻，离心4_6 分钟，取上清液得到供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15 μ 1，注入液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到养血清脑颗粒中芍药苷的含量。
10.根据权利要求9的质量检测方法，其特征在于，步骤如下色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2 : 18 80)为流动相；检测波长为230nm;柱温30°C，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2000，对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述芍药苷对照品溶液5ml，置50ml容量瓶中，加 70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，供试品溶液的制备取养血清脑颗粒适量，研细，取约O. 08g，精密称定，置IOml容量瓶中，加入O. 2%碳酸氢钠溶液5ml，功率500W，频率30kHz的超声处理10分钟，加在60 80 目，内径6 8mm，高约5cm的DlOl型大孔吸附树脂柱上，用水15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇8ml洗脱，收集洗脱液于IOml量瓶中加水至刻度，摇匀，过O. 45 μ m微孔滤膜，即得， 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，得到色谱图，经计算得到养血清脑颗粒中芍药苷的含量。
全文摘要
本发明涉及医药领域，具体涉及一种养血清脑颗粒的质量检测方法，本发明的方法，包括对以下成分的鉴别A夏枯草中熊果酸鉴别，B延胡索鉴别，C决明子鉴别，D当归和川芎鉴别，E夏枯草中迷迭香酸鉴别，F川芎中生物碱鉴别，G川芎中欧当归内酯A鉴别，H鸡血藤鉴别，I白芍鉴别，J熟地黄鉴别，K钩藤鉴别，还包括对养血清脑颗粒中的有效成分芍药苷进行含量测定。
文档编号G01N30/90GK102998410SQ201110269069
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者孙玉侠, 高展, 刘彦莉, 曹凤兰 申请人:天士力制药集团股份有限公司
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