专利名称：测定钠-质子-交换蛋白配体功效的方法
测定钠-质子-交换蛋白配体功效的方法本发明涉及测定离子通道配体的功效的方法。膜转运蛋白的Na+/H+-交换蛋白或者钠_质子-交换蛋白(NHE)家族利用细胞外到细胞内Na+梯度来驱使H+从细胞中流出。这组转运蛋白(或者离子通道)实现的基本功能包括调节细胞体积和PH以及在细胞增殖中的许可作用和Na+的经上皮转运。哺乳动物 NHE是一种发挥将1个细胞内质子交换1个细胞外钠离子作用的膜内在蛋白质。通过涉及离子流动，NHE可用于调节细胞内pH和细胞体积，以及启动细胞生长或者机能状态的变化。 除了其生理学作用之外，NHE还在人病理学中起重要作用。在心肌梗塞期间和之后导致的人心肌膜损伤中，NHE引起的转运起着关键作用，并且被认为代表在癌性细胞的致癌性转化中的重要步骤。因此，NHE多年来已经是心血管和肿瘤学研究中的靶标，并且已经对成千上万种化合物进行NHE抑制性和选择性的筛选。测定NHE拮抗剂的效能的标准方法是ktiwark和其合作者(ktiwark et al., 1998,Pflugers Arch. ,336(5) :797-800)以及Wiemann和其合作者(ffiemann etal.，1999， PflugersArch. ,436(3) =255-262)描述的体外测定。在测定配体在所选的NHE上的IC5tl之后，可用相同的测定测量对其它NHE的选择性。一般而言，选择具有优良选择性的有效力配体用于进一步的药代动力学研究、配体的体内验证研究。然而，一些非常有效力的化合物在体内研究中仅仅显示微小的效果。其原因可能是高的蛋白质结合、低的生物利用度或者其它降低化合物在血浆中的有效浓度的作用。期望在药物开发过程的非常早的时期排除这些化合物以节省时间和资源。由于几种化合物的体外IC5tl与药理学效能(功效)之间的偏差，因而需要发展测定或者模拟NHE配体或者其它离子通道配体在体内的功效的方法。因此，本发明的第一个主题是提供测定离子通道配体功效的方法。优选地，该测试应该是节约时间和成本的。在本申请的上下文中，术语离子通道理解为包括被动的离子通道以及主动的离子通道(离子转运蛋白)。出乎意料地发现，离子通道配体的功效(尤其是NHE拮抗剂的功效)可通过使表达离子通道的细胞与动物血浆和离子通道配体接触来测定。在该测试中，可测定离子通道配体对细胞的作用，其中该作用反映配体的体内功效。因此，本发明的第一方面提供测定离子通道配体的功效的方法，其包括下面步骤a)使表达离子通道的细胞与下面物质接触iii)动物血浆，和iv)离子通道配体；以及b)测定离子通道配体对细胞的作用。简而言之，该方法可如下进行将表达审议中的表达离子通道的适当细胞保持 (例如培养)在适当的条件下，并与动物血浆和所述离子通道配体进行接触(温育)。这两成分可同时或者一起添加。在足以顾及对细胞的作用的时间之后，测定对细胞的作用。在所述接触之后或者同时，观察作用(信号)，其中对作用的检测指示了离子通道配体对细胞的作用。在本发明的上下文中，术语“离子通道配体的功效”涉及离子通道配体的药理学效能。与无血浆条件下的体外测定形成对比，在血浆的存在下进行的本发明方法虑及蛋白质结合量，吸收的程度和速率，配体利用度的分布、代谢和排泄和/或其它降低化合物在血浆中的有效浓度的作用。当将配体给药于动物并从动物取出血浆时，该方法也虑及吸收的程度和速率，配体的分布、代谢和排泄。这些作用可取决于下列因素，包括但不限于药物的物理性质(疏水性、pKa、溶解性)、药物组成、在进食或者禁食状态下给药、生理节奏特性和/ 或与其它药物、食物或者内源物质(例如酶)的相互作用。因此，术语“离子通道配体的功效”不但涉及配体与离子通道的结合和下游信号传导的诱导，而且还虑及配体在血浆和/或活的动物中的上述作用。这允许更方便地确认适于例如体内治疗的候选药物和/或排除具有低体内功效的化合物。配体对细胞的作用可以是对细胞的任何作用，包括但不限于形态学、生存力或者细胞内化合物的组成等的改变。该作用可以是处于任何水平的离子通道信号传导，包括配体与离子通道的结合、离子的流出、各离子与靶标例如细胞内靶标的结合、确定细胞化合物例如第二信使(如cAMP、CGMP、Ca2+、IP3、二乙酰基甘油等)的量、确定细胞内蛋白(例如蛋白激酶A、蛋白激酶C或者MAP激酶)的激活态，确定mRNA或者蛋白质的量、任何改变的细胞机能(例如诱导细胞凋亡或者细胞周期停滞)等。该方法可用来测定或者模拟体内离子通道的配体功效。该方法的应用范围的实例包括以下首先，可测量离子通道配体在源于用离子通道配体给药的动物的血浆样品中的有效浓度(例如参见实施例幻。若将配体给药于动物，与配体的给药量相比低的配体血浆浓度可解释为差的生物利用度(例如由于低的血浆半衰期)。其次，可测定离子通道配体在血浆例如人血浆中的作用(例如参见实施例2)。与不含血浆的测定(这是本领域已知的)中测量的IC5tl相比，可以对配体的血浆结合和体内利用度得出结论。IC5tl与血浆中功效之间差异非常高的化合物可以较早地弃去，因此在药物开发中能潜在地节约成本。目前，这些化合物只能在体内实验之后才弃去。离子通道是一种通常为成孔的蛋白质，其有助于建立和控制离子通过质膜的流动。离子通道是膜内在蛋白质，或者更典型地是几种蛋白质的组装。这样的多亚单元组装通常涉及环绕贯穿质膜的孔紧密堆积的相同或者同源蛋白质的环状排列，所述孔填充有水。 尽管一些通道仅仅基于电荷而允许离子通过，但是原型通道孔在其最窄处仅仅1或2个原子宽。其传导特异的离子例如钠离子或钾离子，并将它们运输通过膜。在一些离子通道中， 通过孔的通路由“门，，控制，该“门，，通过化学或电信号、温度或者机械力开启或者关闭，这取决于离子通道的种类。通常，根据门控、通过这些门的离子种类和孔数，对离子通道进行详细说明。如果通道按门控分类，则通道分成两类电压门控离子通道(激活/失活取决于跨膜的电压梯度)和配体门控离子通道(激活/失活取决于配体与通道的结合)。电压门控通道的实例包括电压门控钠通道、电压门控钙通道、电压门控钾通道、一些瞬时型感受器电位通道、超极化-激活环核苷酸门控通道和电压门控质子通道。配体门控通道的实例包括钾通道例如内向整流钾通道(inward-rectifier potassium channel)、 钙激活钾通道和双孔结构域钾通道、光门控通道如通道视紫红和环核苷酸门控通道。当按通过通道的离子分类时，离子通道一般分为下面几种氯离子通道、钾通道(例如电压门控钾通道、钙离子钙激活钾通道、内向整流钾通道和双孔结构域钾通道)、钠通道、钙通道、质子通道(例如电压门控质子通道)和相对非特异性离子的通用的离子通道(包括大多数瞬时型感受器电位通道)。一些离子通道影响细胞内pH，如碳酸氢钠协同转运蛋白和钠离子质子交换蛋白 (NHE)。离子通道的活性可受到与审议中的离子通道结合的天然或人工产生的配体的影响。 这些配体的众所周知的实例包括阻断钠通道的河豚毒素、海藻毒素、利多卡因和奴佛卡因以及阻断钾通道的树突毒素、非洲蝎毒素(iberiotoxin)和蜘蛛毒素(heteropodatoxin)。如上所述，离子通道配体是与离子通道特异性结合的任意化学物质。“与离子通道特异性结合”根据本发明包括但不限于解离常数Kd不超过10_4mol/l优选不超过10_5mol/ 1的结合。解离常数Kd可以在例如本领域技术人员所熟知的竞争性结合实验中根据下式测定B [L] = [L] / {[L] +KDL (1+ [L*] /KDLJ，其中[L]和[Li分别代表审议中的离子通道配体的浓度和可检测的(例如标记的)离子通道配体如离子通道的放射性配体的浓度。Km和Kdw分别是审议中的离子通道配体和可检测的配体的解离常数，B[L] (0%至100% )是在具体浓度的离子通道配体时的结
口 O在本发明的一种优选实施方案中，待确定的配体是激动剂或者拮抗剂。激动剂与离子通道结合并激活离子通道(例如通过引起构象变化来激活)。拮抗剂或者阻断剂也与离子通道结合并使其失活。如果配体改变了离子通道的状态(活性状态或无活性状态)，则激活和失活可引起可检测的信号。优�。涮迨鞘股笠橹械睦胱油ǖ朗Щ畹霓卓辜痢Ｍü痉⒚鞣椒ū碚鞯呐涮蹇梢杂米饔杏糜谥瘟坪驮し烙肜胱油ǖ老喙氐恼习蚣膊〉那痹谝┪�。在本发明的一种优选实施方案中，离子通道是钠-质子-交换蛋白(NHE)或者钠-碳酸氢根-协同转运蛋白。由于在细胞中起作用的蛋白质例如酶的结构极大地受到PH 的影响，存在蛋白质作用的最佳PH。基于该原因，保持和调节细胞内pH对于细胞保持细胞机能的体内稳态是极其重要的。在细胞的PH调节中涉及NHE以及钠-碳酸氢根-协同转运蛋白。钠-碳酸氢根-协同转运蛋白由细胞膜内外的Na+浓度梯度驱动，并将1个Na+以及1个或多个HCO3-离子一起运入细胞内。由于钠-碳酸氢根-协同转运蛋白存在于细胞膜中并且通过钠-碳酸氢根-协同转运蛋白运入细胞内的HC03_中和了细胞质中的H+，钠-碳酸氢根-协同转运蛋白在调节细胞内PH中起着重要的作用。同样，NHE也在调节细胞内pH中起着重要的作用。迄今，已经在哺乳动物NHE家族中确定了 9种异形体(NHE1至NHE9)。异形体共有约25 70%的序列同一性，其计算相对分子量的范围为约74000 93000。交换蛋白的结构分析表明它们具有相似的膜拓扑，其中氨基端膜结构域由12个跨膜段组成，而羧端细胞质结构域差异较大。很早就已知NHE对于肿瘤生长是重要的，因为当将缺少Na+/H+交换活性的肿瘤细胞移植入丧失免疫的小鼠时，它要么不能生长肿瘤要么显示严重的迟缓生长。现在明显的是，NHEl引起多种变异和/或恶性细胞内PH梯度的逆转从而细胞内环境是碱性而细胞外环境是酸性。该‘恶性酸中毒’被认为代表致癌性转化中的关键步骤且是发展和维持变异表型所必需的。此外，NHE尤其是NHEl牵涉几种疾病的生理学，其中大部分研究集中在NHEl在心脏病和癌症中的作用。正常情况下，在心肌膜中NHEl移去过量的细胞内酸以交换细胞外钠离子。增多的细胞内钠离子被调控膜蛋白移去，所述调控膜蛋白包括Na+/K+ATP酶和Na+/ Ca2+交换蛋白。随着在心肌梗塞期间和之后发生在人类心肌膜中的质子产生的增加，心肌膜出现问题。NHEl异形体是交换蛋白的‘管家’异形体，且在基本上所有组织的质膜中普遍地表达。NHEl异形体是在心肌膜的质膜中发现的主要的NHE异形体。NHE2至NHE5异形体也位于质膜中，但是具有更有限的组织分布。NHE2和NHE3主要位于上皮的顶膜中且高度表达在肾和肠中。与它们成对比的是，NHE4主要富集于胃中，但是也表达在肠、肾、脑、子宫和骨骼肌中，而NHE5主要表达在脑中(但是也可能低水平地存在于其它非上皮组织(包括脾、睾丸和骨骼肌)中)。异形体NHE6至NHE9普遍地表达和存在于细胞内室中。这些细胞器膜 NHE被假定为调节细胞内室的腔内pH和阳离子浓度。NHE6在心、脑和骨骼肌中表达最高， 并位于早期循环核内体。NHE7异形体主要位于转运高尔基氏体网络，并因其介导Na+或者 K+流入以交换H+而不同于其它NHE异形体。最高的NHE8表达见于骨骼肌和肾，并且该异形体主要位于中间-至转运-高尔基氏体室。最近鉴定出的NHE9异形体发现位于晚期循环核内体。NHE是利尿化合物阿米洛利(amiloride)及其类似物和苯甲酰胍衍生物抑制的靶标。对比不同的NHE异形体显示对于这些抑制剂它们具有不同的亲和性，在相似的实验条件下具有下面的敏感顺序NHE1 ^ NHE2 > NHE5 > NHE3 > NHE4。由于NHEl是对抑制最敏感的异形体且似乎是存在于心肌膜的质膜中的最重要的异形体，因此可以治疗上利用这些抑制剂的选择性质。在本发明的优选实施方案中，所述离子通道是NHE，例如NHE1、NHE2、NH3、NHE4、 NHE5、NHE6、NHE7、NHE8 或者 NHE9，优选 NHE1、NHE2、NHE3 或者 NHE5，尤其是 NHEl 或者 NHE3， 特别是NHEl。NHEl异形体是NHE家族的最佳表征的异形体。NHEl为815氨基酸长，其中残基1 至500代表膜结构域，残基501至815代表胞质尾区。对于离子转运，NHEl的膜结构域不但是必要的而且是充分的，而细胞溶质结构域涉及调节交换蛋白的活性。经由交换蛋白的离子流动受到跨膜Na+梯度的驱使，并且看来不需要直接的代谢能量输入。如上所详述，离子通道配体优选为激动剂或者拮抗剂。但是，由于NHE的临床重要性，配体优选为NHE激动剂，更优选为NHE拮抗剂。如果审议中的离子通道在缺少配体时是失活的，那么在激动剂的存在下监控拮抗剂的作用可能是必须的。在此情形下，拮抗剂的作用是使激动剂激活的离子通道失活。根据本发明，将细胞与配体和血浆一起温育。所述细胞可以是表达审议中的离子通道的任何适当细胞。表达审议中的离子通道配体的细胞可以是天然表达离子通道的细胞。作为选择，也可以将细胞进行基因修饰以表达离子通道。如本领域技术人员所知的那样，可以对细胞进行分离(任选地，基因修饰的)，保持和培养。除了温度和气体混合物之外，在细胞培养系统中最常见的变量是生长培养基。 生长培养基的处方可在PH、葡萄糖浓度、生长因子和其它营养成分的存在等等方面上变化。 用于补充培养基的生长因子常常源于动物血液例如小牛血清。如本领域技术人员所知的那样，基因修饰的细胞可以通过插入离子通道的全长编码序列来获得。本领域技术人员知道使用分子生物学的标准技术如何去得到离子通道蛋白的核酸序列编码以及如何分离或产生这样的核酸序列。这可通过例如利用限制性酶来使用和组合现有的序列完成。核酸可以与其它要素例如启动子、转录起始和终止信号、以及翻译起始和终止信号进行组合，以提供离子通道序列的表达。所形成的核酸序列可以例如利用病毒作为载体或者通过转染(包括例如通过电穿孔、热激、磁力转染(magnetofection)、细胞核转染(nucleofection)和使用转染剂)引入细胞中。任选地，细胞可以是组织的一部分；但是本发明方法是离体法。在本发明的一种优选实施方案中，细胞来自细胞系(其中多数是充分表征的，并提供恒定的条件且便于操作)，具体是哺乳动物细胞系，更具体是人或小鼠细胞系，尤其是小鼠LTK-细胞系 LAPl (Franchi et al. , 1986, Proc NatlAcad Sci U SA. 83 (24) :9388-9392)。适当的细胞系的实例包括但不限于 HEK 293、745-A、A-431、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-l、CC531、CFPAC、 CHO、CHO KU COS-U C0S-7、CV-U EAHY, EAHY 926、F98、GH3、H-295R、H-4-II-E、HACAT, HACAT A131、HEK、HEL、HeLa、H印 G2、High Five,Hs 766T、HT29、HUV_EC R24、HUV_EC_C、IEC 17、IEC 18, Jurkat, K 562、KARPAS-299、L 929、LIN 175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、 MT4、N64、NCTC 2544,NDCK II,Neuro 2A、NIH 3T3、NT2/D1、P19、SF9、SK-UT-1、ST、SW 480、 SWU-20S、U-373、U-937和Yl。其它适当的细胞是本领域技术人员已知的那些。优选的细胞系是HEK 293细胞(原代人胚胎肾细胞)、3T3细胞(鼠胚胎成纤维细胞)、CH0细胞(中国仓鼠卵细胞)、C0S-7细胞(非洲绿猴细胞系)、HeLa细胞(人上皮样子宫颈癌细胞)、JURKAT细胞(人T-细胞白血病细胞)、BHK 21细胞(仓鼠正常肾，成纤维细胞)和MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)，尤其是小鼠LTK-细胞系LAPl。在本发明方法中，将细胞(如上所指出的)与动物的血浆一起温育。所述动物可以是脊椎动物，具体是哺乳动物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者猫，它们提供在实验室中方便和安全的操作。为了提供最有意义的人医学结果，血浆也可以源于人类。因此，静脉血可以由人供体的静脉穿刺获得，其中对于本发明方法(参见实施例)通常仅仅少量样品例如5ml至 25ml血液样品就足够了。血液通常从前臂前区(肘的中隆内的一侧)上的肘正中静脉获得。该静脉靠近皮肤的表面，此处没有大的神经分布。在发达国家中的大多数血液采集借助由塑料针座、皮下注射针和真空管组成的抽真空管系统完成。根据本发明方法，测定离子通道配体的功效。功效通过测定在血浆的存在下离子通道配体对细胞的作用来确定。如上所详述，可在信号传导的各水平时评价配体对细胞的作用，包括配体与离子通道的结合，各离子与靶标的结合，确定细胞化合物例如第二信使的量，确定mRNA或者蛋白质的量，任何改变的细胞机能(例如诱导细胞凋亡或者细胞周期停滞)等。测定配体与靶标的结合的方法是本领域技术人员熟知的，包括本文指出的那些。确定mRNA或者蛋白质的量的方法也是本领域技术人员熟知的。观察细胞机能的改变的方法很大程度取决于细胞机能的类型，并且也是技术人员熟知的。
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测定离子通道配体对细胞的作用的方法可能包括异相或者单相测定。本文中使用的异相测定是包括一个或多个洗涤步骤的测定，而在单相测定中，这样的洗涤步骤不是必须的。试剂和化合物仅仅进行混合和测量。本发明方法也可包括离子通道下游信号特异性的抗体。所述测定可以是ELISA(酶联免疫吸附测定)、DELFIA(解离放大镧系荧光免疫测定)、SPA(闪烁亲近测定)、flaShplate测定、FRET (荧光共振能量转移)测定、TR-FRET (时间分辨荧光共振能量转移)测定、FP (荧光极化)测定、ALPHA (放大荧光亲近单相测定)、 EFC(酶片段互补)测定、二杂环测定或者共免疫沉淀测定。在本发明的另一种实施方案中，检测功效的方法可以包括测量一种或多种第二信使例如cAMP或者磷脂，优选磷脂酰肌醇磷酸酯。该测量可包括测定一种或多种第二信使的浓度。测定一种或多种第二信使的浓度的手段和方法是本领域技术人员熟知的，包括涉及例如标记的前体优选标记的第二信使前体(例如[32P]ATP或者[3H]肌醇)的那些，其中包括通过例如柱色谱或者质谱纯化。磷脂的改变通常在钙通道处尤其相关。如果审议中的离子通道例如NHE或者钠-碳酸氢根-协同转运蛋白影响pH值，则通过本发明方法测定的作用是PH值的改变，优选细胞内pH值的改变。在本发明的一种优选实施方案中，离子通道配体对审议中的离子通道例如NHE或者钠-碳酸氢根-协同转运蛋白的作用通过荧光测定。荧光是一种光学现象，其中光子的分子吸收引发以更长的波长发射另一光子。吸收光子与发射光子之间的能量差以分子振动或者热形式耗散。通常，吸收光子在紫外光区而发射光在可见光区，但是这取决于具体荧光团的吸收曲线和斯托克位移。荧光应用在生物医学和相关科学中越来越广泛。在些领域中的分析方法也越来越多，尽管是日益增多的以缩写形式的令人遗憾的命名FLIM、FLI、FLIP、CALI, FLIE、FRET、FRAP、FCS, PFRAP、 smFRET、FIONA、FRIPS、SHREK、SHRIMP、TIRF。这些技术的大多数依赖于荧光显微镜。这些显微镜使用高强度的光源(通常汞或者氙的灯、LED或者激光)来在待观测的样品中激发荧光。然后滤光片将激发光与发出的荧光分开，用眼睛或者(CCD)相机或其它光检测器(光电倍增管、摄谱仪等)检测。为了检测审议中的信号(此处为离子通道配体的作用)，通常使用荧光染料或者标志或标记。荧光染料包含荧光团。类似于生色团，荧光团是引起分子发荧光的分子成分。 它是分子中将吸收特定波长能量再发出不同(但也是特定的)波长的能量的官能团。发出的能量的数量和波长取决于荧光团和该荧光团所处的化学环境。异硫代氰酸酯荧光素(荧光素的反应衍生物)已经成为一种最常见的与其它非荧光性分子进行化学连接以产生用于各种应用的新的荧光性分子的荧光团。其它历史上常用的荧光团是若丹明、香豆素和花青的衍生物。荧光染料的实例包括但不限于7-氨基-放射菌素D、吖啶橙、吖啶黄、Alexa Fluor、AnaSpec、金胺0、金胺-若丹明染色剂、苯并蒽酮、9，10-二(苯基乙炔基)蒽、5， 12-二(苯基乙炔基)丁省、CFDA-SE、CFSE、钙黄绿素、羧基荧光素、l-氯-9，10-二(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9，10-二 (苯基乙炔基)蒽、香豆素、花青、DAPI、Dioc6、DyLight Fluor、溴化乙锭、荧光素、Fura-2、Fura_2-乙酰氧基甲基酯、绿色荧光蛋白、Hilyte Fluor、Hoechst 染色剂、Vidian黄、Indo-Ι、荧虫素、二萘嵌苯、藻胆色素、藻红蛋白、藻红素、碘化丙锭、荧光黄(pyranine)、若丹明、RiboGreeru红荧烯、三(4，7-二苯基-1，10-菲绕啉酯)钌(II) (ruthenium(II) tris (bathophenanthroline disulfonate))、STOR 绿、均二苯乙烯、磺酰罗丹明101、TSQ、Texas红、伞形酮、黄色荧光蛋白或者BCECF。根据一种优选的实施方案，使用BCECF。BCECF为2'，7'-双(羧乙基)_5 (6)-羧基荧光素，C27H2tlO11),M = 520，45g/mol，CAS 号:85138-49_4，存储；2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基荧光素的类似物，由于其在细胞内增强的保留因而能更好地用于在淋巴细胞中PH测定。为了充分摄入完整细胞中，BCECF可以以乙酰氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在细胞内剪切成更不能渗透的BCECF。70nM的BCECF溶液的最大激发位于500nm。BCECF的荧光强度可以受到几种试剂的影响，所述试剂例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。 BCECF的适当浓度为5 μ M(最终浓度)。在本发明的上下文中，荧光染料对于离子通道配体对离子通道的作用是敏感的。 该作用可以是对通道本身的直接作用(例如构象变化、结合特性的变化等)或者审议中的离子通道的下游的信号途径变化，具体是通过审议中的离子通道转运的离子的细胞内浓度变化。所述离子可以是例如H+、HC0” K+、Na+、Cl—或者Ca2+。适当的pH依赖性荧光标志 (针对H+和HCO3-)包括但不限于H+选择性荧光生色团ETH 5294, S NAFL, SNARF, HPTS、荧光素、羧基荧光素、BCECFO' ,7' -二(2-羧乙基)5(和6)羧基荧光素)和BCPCFO'， 7' -二(2-羧丙基)-5(和6)羧基荧光素)。钙离子可通过使用下面物质检测水母素 (待分离的第一发光蛋白)、用Alexa-488或者photina标记的钙调蛋白(Axxam SpA，意大利米兰)、Fluo4 (甘氨酸，N-[4-[6-[(乙酰基氧基)甲氧基]_2，7- 二氟-3-氧代-3H-夹氧杂蒽-9-基]-2-[2-[2-[ 二 [2-[(乙酰基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]氨基]-5-甲基苯氧基]乙氧基]苯基]-N-[2-[(乙酰基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]-，(乙酰基氧基)甲基酯，C51H50F2N2O23)，M = 1096. 95g/mol, CAS 号:273221-67-3,存储2 至 8 °C，避光)或者Fura-2(5-噁唑羧酸，2-(6-( 二乙酰基氧基)甲氧基)_2_氧代乙基)氨基)-5-0-(2-( 二(2-((乙酰基氧基)甲氧基)-2-氧代乙基)氨基)-5-甲基苯氧基)乙氧基)-2-苯并呋喃基)_(乙酰基氧基)甲基酯，C44H47N3O24)，M = 1001. 86g/mol, CAS号 108964-32-5，存储-20°C，避光)。为了检测钠离子和钾离子，可使用离子载体X和离子载体BME-44。上述方法可如下进行，其中下面仅供示例说明用。本领域技术人员会理解可以以不同方式进行一个或多个步骤(例如如本发明的说明书所述)细胞可以通过从组织中分离来获得，用于离体培养。例如可将组织的片段置于生长培养基中，长出的细胞可用于培养。该方法被称为移植培养。作为选择，可使用细胞系 (例如确立或者永生化细胞系)。存在许多种代表具体细胞类型的确立细胞系(也参见前述)O细胞可培养在适当的培养基(例如可商购的包含血清和抗生素的培养基)。细胞通常培养在适当的氛围(例如5% CO2)、相对湿度(例如90% )和温度(例如在37°C )中。 为了高通量筛选和/或常规操作，细胞可培养在多孔板例如96孔板、M孔板等。如上所详述，可使用荧光标志测定细胞内pH变化。适当的标志包括SNARF-I、 BCECF和CMFDA。激发和发射是激发485，发射590nm(对于羧基SNARF-1)；激发500，发射538nm(对于BCECF)；以及激发485，发射538nm(对于CMFDA)。激发和发射带宽可以分别是20nm和25nm。测量细胞内pH的适当装置例如是FLUOstar 97荧光计多孔板读数器 (BMGLabTechnologies, Inc, Durham, NC)或者实施例中所述的装置。
根据一种实施方案，使用荧光染料BCECF，即2'，7' -二(羧乙基)_5 (6)-羧基荧光素，C27H2tlO11)，M= 520，45g/mol，CAS 号:85138-49_4，存储2 至 8°C，避光。BCECF 是羧基荧光素的类似物，由于其在细胞内增强的保留因而能更好地用于在淋巴细胞中PH测定。为了充分摄入完整细胞中，BCECF可以以乙酰氧基甲基酯BCECF/AM的形式使用，其在细胞内剪切成更不能渗透的BCECF。70nM的BCECF溶液的激发最大位于500nm。BCECF的荧光强度可以受到几种试剂的影响，所述试剂例如甘油、蔗糖、聚乙二醇或者聚乙烯吡咯酮。BCECF 的适当浓度为5 μ M(最终浓度)。下面是制备用于细胞内PH测定的细胞的一个示例性方法细胞可以生长至例如 90%铺满，用例如胰蛋白酶收获，并立即用含有例如10%胎牛血清的培养基淬灭，造粒，然后淋洗1次。将细胞粒再混悬于新鲜的培养基中，使其复原(例如在5%C02，37°C条件下1 小时)，用例如不含碳酸氢盐的缓冲液(例如130mM NaCl,4. 7mM KCl、1. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES，pH 7.4)淋洗例如两次，然后加载上面的标记物(染料)。根据另一实施方案，在加载染料之前，细胞未用胰蛋白酶处理。染料加载例如可以如下进行在室温将细胞用5 μ M的5-(和-6)-羧基SNARF-I/ AM (Molecular Probes, Eugene, OR)温育在不含碳酸氢盐但含有 (wt/vol) Pluronic F-127 (Sigma Chemicals, St Louis,MO)的Krebs-H印es 缓冲液(pH 7.4)中 30 分钟。细胞可以在室温在缓冲液中用例如ΙμΜ的2，7-二(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(BCECF/ AM) (Molecular Probes)加载45分钟。细胞可以在37°C在缓冲液中用5 μ M CellTracker 绿色CMFDA(5-氯甲基荧光素二乙酸酯)(Molecular Probes)加载45分钟。用一种或多种其它上述染料加载可以根据合适且熟知的规程类似地进行。在加载之后，细胞可以例如用缓冲液淋洗一次或多次(例如2次)，并再混悬于新鲜的培养基中，使其在5% CO2于371复原1小时或更长时间(例如过夜)。在染料加载和复原时间之后，可将细胞用合适的缓冲液例如不含碳酸氢盐的Krebs-ifepes缓冲液(pH 7. 4或者6. 0)淋洗一次或多次(例如3次)，再混悬成最终浓度2. 5x IO6个细胞/毫升并保持在4°C。细胞可稀释和平均地分布(约35000个细胞/孔)至不透明的白色96孔板(或者任何其它适当的板，例如具有透明底的黑色板)。血浆和仅仅的缓冲液或者含有配体的缓冲液可先后注入各孔中，并以合适的间隔(例如20秒)记录荧光强度。在各注入之前，以合适的间隔(例如20秒间隔)记下几个(例如5个)基线读数。在各实验结束时，用已知的离子通道配体(例如针对H+/K+交换蛋白，尼日利亚菌素)进行原位校准的方法可用于使荧光强度与PH值相关。这例如可以如此完成通过使细胞在去极化高 K+缓冲液(140mM KClU. 2mM MgSO4U. 2mM KH2PO4Ul. 7mM D-葡萄糖、1.3mM CaCl2UOmM HEPES, pH 6. 0至8. 0，在20 μ M尼日利亚菌素存在下)中暴露于不同的pH缓冲液，将K+/H+交换蛋白离子载体设置[K+]o= [K+] i和pHo = pHi。为了校正校准与实验之间的小的细胞密度偏差和照明强度不稳定，通过在各实验结束时用0. 1% Triton X-100 透化处理细胞并用KOH调节pH至11来测量CMFDA浓度。此外，可通过分离出来自漏出的和细胞内染料的贡献来跟踪染料漏出。为此，可将细胞以不同时间间隔离心例如30秒。然后，可测量各上清液和再悬浮细胞裂解物溶液的荧光强度。上清液的荧光强度反映染料从细胞中漏出，上清液和细胞裂解物的合并荧光强度
10可用于定义染料的总量。对照(没有染料)的荧光强度可从各部分中减去，漏出可报道为荧光强度(上清液/总量)之比对时间的关系。进一步示例性方法描述在下面的实施例中。作为选择，离子敏感性微电极(包括离子选择性离子载体例如钠离子载体二 (12-冠醚-4)，钾离子选择性离子载体二(苯并-15-冠醚-5)，钙离子选择性离子载体HDOPP-Ca)或者离子敏感性酶(例如钾依赖性脲酰胺分解酶、丙酮酸激酶(美国专利 5，501，958和5，334，507)或者甘油脱氢酶(美国专利5，719，036))可以用于检测穿过细胞膜的离子流出。其它PH敏感性方法包括弱酸或碱的分布、31P-NMR光谱和pH敏感性绿色荧光蛋白[GFP]。优选地，采用高通量筛选的方法。在该方法中，针对审议中的离子通道，在全细胞测定中对大量化合物进行筛选。通常，这些筛选利用基于自动机器工作台的技术或者以较高密度阵列(“芯片")格式在96孔板中进行。在本发明方法的一种实施方案中，将离子通道配体例如NHE配体给药于细胞以及血浆。这可通过将配体给药于非人类动物来实现。配体可以以任何适当的途径给药，包括肠胃外(例如静脉、动脉内、肌肉、心内、皮下、皮内、鞘内、腹膜内)，肠内(例如口腔或者直肠)，表面(例如上表皮、吸入、鼻内或者阴道)等给药。优选喂食给药。在足以使配体存在于血浆中的时间量之后，对动物采集血浆。为了实施本发明方法，将包含配体的血浆加入细胞中，测定配体对细胞的作用。该作用的测定可包括测定血浆中配体浓度(同样参见实施例幻。如果将给药于动物的配体的量与血浆中存在的配体量进行比较，则可从该比较中得出关于例如吸收的程度和速率以及配体的分布、代谢和排泄的结论。根据本发明，测定离子通道配体作用的方法可用于测定配体的血浆浓度。这可通过将具有未知配体浓度的血浆的作用与标准例如标准曲线进行比较来完成(参见例如实施例2)。本发明方法可用于筛选预防和/或治疗涉及离子通道机能障碍的疾病尤其是预防和/或治疗心血管疾病或者癌症的药物。如果用于筛选目的，测试的配体可以是已知的离子通道配体或者功能仍然未知的或者还未与离子通道相关的物质。因此，本发明方法可以用于确认新的离子通道配体。作为选择，可利用本发明方法对已知的离子通道配体测试其功效。可将该功效与在不含血浆的系统中的配体作用(例如结合亲合力)进行比较，从而评价血浆对配体活性的影响和估计配体的体内活性。配体可以以化合物库的形式提供。化合物库包括大量化合物，并且汇编自多种来源中的任一种(包括化学合成的分子和天然产物)，或者通过组合化学技术产生。它们尤其适于高通量筛选。它们可以由具有特定结构的化合物或者特定生物例如植物的化合物构成。在本发明的上下文中，所述化合物库优选包含小分子的化合物库。下面通过附图
和实施例来说明本发明，这不意在限制本发明的范围。附1显示在大鼠血浆中的计算功效的卡立泊来德校准曲线(EC5tl = 115nM)。图2显示在大鼠血浆中的计算功效的新型化合物X校准曲线(EC5tl = 662nM)。图3显示利用NHEl体外测定估计的卡立泊来德和化合物X血浆浓度。实施例实施例1 建立一种测定来确定在动物血浆样品中NHE拮抗剂有效浓度血浆样品得自新西兰雄兔(2. 5-3. 5kg)，该标准兔子食用0. 3 %卡立泊来德(NHE 抑制剂)。在一周之后从耳动脉采取血样，用于测定卡立泊来德的血浆浓度。测定卡立泊来德的血浆浓度如下所述进行将NHE-基因(SLC9A1，Franchi A. etal. ,Proc Natl Acad Sci USA.，1986Dec ； 83(24) =9388-92.)克隆至pMamneo-载体然后引入到LAPl (小鼠LTK-细胞系)细胞中。稳定的细胞系由转染的细胞产生。将稳定表达人NHEl (hNHEl)的LAPl (小鼠LTK-细胞系)细胞以密度25，000个细胞/孔/100 μ 1培养基(Iscove-培养基，10%FCS，2mM L-谷氨酰胺，100u/ml青霉素/链霉素，50 μ g/ml庆大霉素，400 μ g/ml G418)在透明底的96孔黑色微量板(Costar , Corning Inc.，Corning, NY)上接种。将细胞在37°C>5% CO2和90%湿度的条件下温育过夜。在测量之前弃去培养基，并加入100 μ 1/孔的染料缓冲液OOmM HEPES,用KOH调节至ρΗ 7. 4， 20mMNH4Cl，115mM 氯化胆碱，ImM MgCl2, ImM CaCl2, 5mM KC1，5mM 葡萄糖，5 μ M BCECF)。在 37°C温育20分钟之后，用不含Na+的洗涤缓冲液(5mM HEPES，用KOH调节至ρΗ 7.4,133. 8mM 氯化胆碱，4. 7mM KCl，1. 25mM CaCl2,1. 25mM MgCl2,0. 97mM K2HPO4,0. 23mM KH2PO4, 5mM葡萄糖)洗涤细胞3次，使每孔剩余90μ 1洗涤缓冲液。用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices, Sunnyvale, CA ；激光功率 0. 3W，孔径 4，测量间隔 k，测量时间 120s)测量ρΗ恢复。在测量期间，向各孔加入90 μ 1血浆溶液(90%的来自未喂食拮抗剂的动物的动物血浆，10%的Na+-缓冲液IOmM HEPES，用KOH调节至pH 7.4,133. 8mM NaCl, 4. 7mM KCl，1. 25mM MgCl2,1. 25mM CaCl2,0. 97mM Na2HPO4,0. 23mM NaH2PO4, 5mM 葡萄糖)。由于缓冲液中的Na+，NHEl开始从细胞中转运出H+，导致细胞内ρΗ升高和产生荧光。高对照 血浆溶液，无拮抗剂。低对照血浆溶液，具有20 μ M卡立泊来德(10 μ M最终浓度)。在制备后将卡立泊来德加入血浆中。加入10 μ M卡立泊来德导致完全阻断NHEl活性。为了校准，在制备后将不同量的卡立泊来德和测试拮抗剂加入血浆中以确定在动物血浆中的功效。为了计算NHEl活性，计算第12秒和第32秒之间的荧光增大。高对照设为100% 的NHEl活性，而低对照确定为0%的NHEl活性。样品通过与对照进行比较来计算样品的％ 活性。表1 用源自兔子的血浆进行的血浆测定实施例
权利要求
1.测定离子通道配体的功效的方法，其包括下面步骤a)使表达离子通道的细胞与下面物质接触i)动物血浆，和ii)离子通道配体；以及b)测定离子通道配体对细胞的作用。
2.权利要求1的方法，其中所述离子通道是钠-质子-交换蛋白(NHE)或者钠-碳酸氢根-协同转运蛋白。
3.权利要求1或2的方法，其中所述NHE是NHEl、NHE2、NHE3或者NHE5，尤其是NHEl 或者NHE3，特别是NHE1。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述离子通道配体尤其NHE配体，是激动剂或者拮抗剂，尤其是NHE拮抗剂。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述细胞是细胞系，具体是哺乳动物细胞系， 特别是人或小鼠细胞系，尤其是小鼠LTK-细胞系LAP1。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述动物是脊椎动物，具体是哺乳动物，尤其是大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或者猫。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述动物是人。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述作用是改变pH值。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述作用是改变细胞内pH值。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述作用通过荧光得到测定。
11.权利要求1至6和8至10中任一项的方法，其中NHE配体已被给药于所述动物，该动物是非人类动物。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述方法用于测定配体的血浆浓度。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法用于筛选用来预防和/或治疗涉及离子通道机能障碍的疾病的药物。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述方法用于筛选用来预防和/或治疗心血管病或者癌症的药物。
全文摘要
本发明涉及测定离子通道配体的功效的方法，包括(a)使表达离子通道的细胞与(i)动物血浆和(ii)离子通道配体接触，以及(b)测定离子通道配体对细胞的作用。
文档编号G01N33/58GK102227640SQ200980147360
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月26日
发明者厄休拉·欣德勒, 托马斯·利彻, 斯蒂芬·谢弗, 汉斯-威利·詹森 申请人:赛诺菲-安万特
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